14. Методы определения пространственной структуры белка.

• рентгеноструктурный анализ

• криоэлектронная микроскопия (реконструкция 3D изображения)

• атомная силовая микроскопия (используется лазер и сканер)

• спектроскопия ЯМР (+корреляция спектров отражения)

15. Четвертичная структура белка. Взаимодействия аминокислотных радикалов, стабилизирующие четвертичную структуру.

• способ укладки в пространстве отдельных полипептидных цепей, обладающих одинаковой (или различной) более низкой структурой, и формирование единого в структурном и функциональном отношении молекулярного образования. Это агрегация нескольких белковых цепей с образованием единой молекулы («суперглобулы»).

Взаимодействия:

1. гидрофобные

2. водородные между радикалами а.к.о.

3. Электростатические (гемоглобин — asp-his, asp-arg, COO-lys, COO-NH3+)

4. координационные связи с металлами

Гемоглобин — первый белок, у которого была определена четвертичная структура ( две альфа и две бета цепи+гем). Способен к обратимой диссоциации. При связывании с кислородом гистидин встает перпендикулярно плоскости порфиринового кольца. Поверхностный белок вируса гепатита В — 2 домена. Капсиды вирусов — вообще надмолекулярные структуры.

16. Методы анализа белков, основанные на их физико-химических свойствах (хроматография, гель-электрофорез).

Хроматография:разделение анализируемых веществ и их концентрация в определенном слое адсорбента с последующим смывом их из колонки элюентом

• адсорбционная — разделение по сорбируемости на твердом сорбенте (акт уголь, Al2O3)

• распределительная — движение в растворителе на бумаге, движение в растворителе в силикагеле. Твердая адсорбционная фаза — только опора для жидкой

• ионообменная — реакция белков с ионообменными смолами в зависимости от их заряда задерживает их в колонке, в то время как другие беспрепятственно элюируются. Задерженные снимаются солевыми растворами

• аффинная (по сродству) — реакция белков со специфическими лигандами (гормон-рецептор и т.д.)

• гель-хроматография (разделение белков на основе их молекулярных размеров:большие молекулы не проникают внутрь жидкой фазы сефадекса и остаются в колонке, смываясь элюэнтом последними)

Электрофорез:разделение на основе заряда молекул или массы при использовании ДДС Na (быстрота прохождения в геле под действием поля). Диск-электрофорез — используется гель с разной степенью пористости и разным рН. Выявление — р-ры Кумасси, амидо черный, бромфеноловый синий. Изотахофорез — на основе pI белков движение в градиенте рН.

17. Ферменты. Специфические черты биологического катализа. Химическая природа ферментов. Ферментативные и неферментативные химические реакции в клетке.

Ферменты (энзимы) — это высокоспециализированный класс веществ белковой природы, используемый живыми организмами для осуществления с высокой скоростью многих тысяч взаимосвязанных химических реакций, включая синтез, распад и взаимопревращение огромного множества разнообразных химических соединений.

Особенности ферментов как биологических катализаторов:

• химическая природа ферментов — белки, рибозимы (РНК-ферменты)

• необычайно высокая эффективность (ускоряют реакцию в 10^5-10^17 раз)

• высокая специфичность действия в отношении химической природы субстрата и типа реакции. Каждый фермент катализирует в основном только определенную реакцию. Это обусловлено конформационной и электростатической комплементарностью молекул субстрата и фермента и уникальной структурной организацией активного центра для «узнавания», высокого сродства и избирательности протекания реакции. Есть ферменты с групповой (относительной) и индивидуальной специфичностью.

• Для каждого фермента характерны специфическая последовательность расположения а.к.о и пространственная конформация. Молекула фермента характеризуется уникальной структурой, определяющей ее функции

• активность ферментов в клетке контролируется как на генетическом уровне, так и посредством определенных низкомолекулярных соединений (субстратов, продуктов реакций, ингибиторов...)

• зависимость эффективности от температуры (термолабильность — чувствительность к повышению температуры, наличие оптимальной температуры для МАХ скорости реакции) и рН (обычно более активны в пределах узкой зоны рН, близкой к физиологическим значениям)

Фермент снижает барьер энергии активации реакции, чтобы она могла идти активнее. Еа фермента ниже, чем без него, но на ΔG (Gпродуктов-Gреагентов) фермент не влияет.

Каталитический цикл включает в себя связывание активного центра фермента с субстратом, образование фермент-субстратного комплекса, затем непосредственно катализ с получением фермент-продуктного комплекса и его последующим распадом на свободный фермент (в ходе реакции его количество не меняется) и продукт.

В настоящее время получены неопровержимые доказательства белковой природы ферментов, хотя раньше в этом сомневались:

• факт инактивирования ферментов при кипячении, действии узлучениями, агрессивными реагентами (денатурация)

• при гидролизе ферменты распадаются на АК

• И.П.Павлов: существует прямая зависимость между переваривающей способностью желудочного сока и количеством в нем белка

• выделение ферментов в чистом виде и в форме кристаллов белка

Ферменты (как и все белки) обладают рядом химических свойств:

• амфотерность (существование в растворе в виде анионов, катионов, цвиттерионов)

• электрофоретической подвижностью (есть заряды)

• в изоэлектрической точке неподвижны в поле

• неспособны к мембранному диализу

• имеют большую молекулярную массу

• оказывают высокоспецифическое действие

Условия применения ферментов: оптимальная температура (некоторые чувствительны к пониженной!), хранение в высушенном или замороженном состоянии.

Практически все реакции в клетке (кроме элементарных с низкомолекулярными веществами) катализируются ферментами.