Раздел I. Лабораторные методы исследования периферической крови и костного мозга

В понятие клинический или общий анализ крови входит: 1) подсчет количества эритроцитов в 1 литре крови; 2) определение количества гемоглобина; 3) вычисление цветового показателя; 4) подсчет количества лейкоцитов в 1 литре крови; 5) подсчет лейкоцитарной формулы;6) определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ).

Полный клинический анализ крови дополняется определением количества тромбоцитов, ретикулоцитов, время свертывания и длительность кровотечения.

I. Определение гемоглобина по Сали

Количество гемоглобина определяется колориметрическим методом. т. е. путем сравнения цвета исследуемого раствора с цветом стандартов, концентрация которых известна.

Устройство гемометра Сали. Гемометр Сали (модель ГС-3) имеет пластмассовый корпус, задняя стенка которого сделана из матового стек­ла, рассеивающего свет. В корпус вмонтированы 3 стеклянные про­бирки, из них две боковые, запаянные с обеих концов, содержат стан­дартный раствор хлорида гематина в глицерине. Цвет жидкости в стан­дартных пробирках соответствует цвету 2% раствора хлорида гематина. Между двумя стандартами вставлена градуированная пробирка. На всех трех пробирках нанесены по две круговые метки: нижняя соответствует вместимости 0,2 мл, верхняя — 2 мл. Средняя пробирка гемометра имеет шкалу, которая градуирована в грамм-процентах (г%), т. е. выражает количество гемоглобина в граммах, содержащееся в 100 мл крови. Цена одного деления шкалы 0,2г%.

К гемометру прилагается капилляр, имеющий одну отметку 0.02 мл (капилляр Сали), резиновая трубочка со стеклянным наконечником. тонкая стеклянная палочка и глазная пипетка.

Реактивы: I) 0,1 Н раствор хлористоводородной кислоты; 2) дис­тиллированная вода.

Техника определения. В градуированную пробирку гемометра на­ливают 0,1 Н раствор хлористоводородной кислоты до нижней круго­вой метки 0,2 мл. Кожу пальца дезинфицируют, дают ей высохнуть и делают прокол. Первую выступившую каплю крови стирают. Слегка надавливая на палец, выжимают новую куполообразную каплю. В ка­пиллярную пипетку Сали набирают кровь до метки 0,02 мл. Соотно­шение количества крови и хлористоводородной кислоты должно быть 1:10. Капиллярную пипетку погружают в среднюю пробирку гемометра и выдувают из нее кровь на дно пробирки, затем тщательно перемеши­вают с хлористоводородной кислотой и оставляют на 5 мин. За это время эритроциты гемолизируются и гемоглобин превращается в хло­рид гематина бурого цвета. По истечении указанного времени в граду­ированную пробирку по каплям вносят дистиллированную воду. Со­держимое пробирки размешивают тонкой стеклянной палочкой. Раз­ведение продолжают до полного совпадения цвета жидкости в градуи­рованной пробирке с цветом стандарта.

Показания гемометра снимают по нижнему мениску жидкости в градуированной пробирке. Полученная цифра указывает концентрацию гемоглобина в грамм-процентах. Для того, чтобы выразить концентрацию гемоглобина в единицах Международной системы (СИ), т. е. в граммах на литр крови (г/л), необходимо количество гемоглобина 1 в г% умножить на 10. Пример: 12 г%х10=120г/л.

Определение гемоглобина на фотоэлектроколориметре

Колориметричесикй визуальный метод определения всегда субъективен и поэтому неточен.

Для получения точных объективных данных о светопоглощении применяются приборы, снабженные фотоэлементами, — фотоэлектроко-лориметры, спектрофотометры и др.

Способы определения гемоглобина на ФЭКе основаны на образовании стойких, окрашенных соединений при взаимодействии его с различными веществами: аммиаком, ацетонциангидрином и др. Наиболее распространен гемиглобинцианидный метод. Гемоглобин, взаимодействуя с ацетонциангидрином, в присутствии железосинеродистого калия образует гемиглобинцианид красного цвета, интснсивность окраски которого пропорциональна содержанию гемоглобина в пробе крови.

Содержание гемоглобина определяют по калибровочному графику, | который строится по стандартному раствору гемоглобинцианида.

2. Подсчет эритроцитов и лейкоцитов в счетной камере

В настоящее время широко используется пробирочный метод. Для разведения эритроцитов применяется 3% раствор NaCl. В тех случаях, когда нельзя произвести подсчет вскоре после взятия крови, для лучшего сохранения эритроцитов пользуются жидкостью Гайема (6,5 грамма сулемы, 1 г NаС1, 5 г сульфата натрия, дистиллированная вода до объе­ма 200 мл).

При внесении 0,02 мл крови в 4 мл раствора КаС1 получается разве­дение в 200 раз, что необходимо для подсчета эритроцитов.

При внесении 0,02 мл крови в 0,4 мл 3% раствора уксусной кислоты получается разведение в 20 раз, что требуется для подсчета лейкоцитов.

Для подсчета форменных элементов разведенную кровь помещают в счетную камеру, в которой клетки располагаются в один слой.

Счетная камера представляет из себя толстое предметное стекло, разделенное четырьмя поперечными бороздами на пластинки — две боковые и среднюю. Средняя пластинка на 0,1 мм ниже боковых, она разделена поперечной бороздкой на две равные части. На каждой по­ловине средней пластинки нанесена сетка Горяева (рис. 1).

Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов, часть которых разделена на 16 малых. К камере прилагается шлифованное покровное стекло, которое притирается к камере так, чтобы появились радужные, Ньютоновские кольца. Подсчет производится под малым увеличением микроскопа, конденсор должен быть опущен, а диафрагма закрыта.

Подсчет эритроцитов осуществляется в 5 больших квадратах сетки Горяева, разграфленных на 16 малых и расположенных по диагонали, и Полученное при подсчете число эритроцитов умножают на 10000.

Подсчет лейкоцитов производят в 100 больших неразграфленных квадратах, расположенных но всей сетке группами по четыре. Полу­ченное число лейкоцитов умножают на 50.на пограничных линиях, следует соблюдать следующие правила:

1. к данному квадрату принадлежат клетки, находящиеся большей своей поло­виной внутри него;

2. клетки, разделенные пограничной линией пополам, считают только на вер­хней и левой границе квадрата;

3. клетки, лежащие большей своей половиной вне данного квадрата, не счита­ются.

Подсчет форменных элементов с помощью автоматических счетчиков

Автоматические устройства, предназначенные для подсчета частиц, взве­шенных в жидкостях (эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов), широко приме­няются в биологии и медицине.

Прибор регистрирует и подсчитывает импульсы, возникающие в момент прохождения каждой частицы через капиллярное отверстие, включенное в электрическую цепь. Наибольшее распространение по­лучили такие приборы, как целлоскоп, измеритель концентрации мик­рочастиц (ИКМ), пикоскале.

3. Вычисление цветового показателя

Цветовой показатель отражает соотношение между концентрацией гемоглобина и числа эритроцитов в крови. Его вычисляют путем деле­ния утроенного числа гемоглобина в г/л на первые три цифры числа эритроцитов в миллионах.

Ц. П. = 3 - кратное количество гемоглобина в г/л

три первые цифры числа эритроцитов в миллионах

Пример: Б-ой Л., Нв — 120 г/л, эритроцитов -. 4,0 10 ^12/л, ц. п. = 3*120 =0,9

400

4. Подсчет лейкоцитарной формулы

Техника приготовления мазка. После прокола пальца первую каплю крови стирают ватным тампоном. К куполу следующей капли прикаса­ются предметным стеклом на расстоянии 1,5 — 2,0 см от его края. Шлифованное стекло помещают перед каплей крови под углом в 45 градусов и делают движение назад к капле, чтобы кровь растеклась рав­номерно по ребру стекла. Затем быстро и легко без нажима ведут шли­фованное стекло справа налево, равномерно распределяя кровь по пред­метному стеклу.

Требования, предъявляемые к мазку: а) вся капля крови должна быть использована для мазка; при этом условии мазок заканчивается неров­но — "метелочкой"; б) мазок должен занимать примерно 3/4 предмет­ного стекла; в) хорошо должен быть выражен край мазка; г) мазок дол­жен быть полупрозрачен и иметь желтоватый тон.

Приготовленный мазок фиксируется. В качестве фиксирующих жид­костей применяют метиловый спирт или смесь Никифорова, этиловый спирт. Реже употребляют для этой цели хлороформ и формалин. Ме­тиловым спиртом мазки фиксируют 3-5 мин, смесью Никифорова — 10-15 минут. Продолжительность фиксации 96% этиловым спиртом 20-25 мин. Для фиксации хлороформом мазок опускают в него лишь на несколько секунд. В формалине мазок фиксируют 1 мин.

Для окраски мазка используется краска Романовского. Продолжи­тельность окраски 30-40 мин. По истечении этого времени мазок про­мывают водой и высушивают на воздухе. Принцип окраски мазков по Романовскому заключается в сочетании щелочной синей краски — метиленовой синьки, с кислой красной краской — эозином. Структурные части клетки (ядро, цитоплазма, зернистость) имеют различную реак­цию. Они поглощают краситель противоположной реакции и окраши­ваются: щелочные части клетки — кислой краской в красный цвет, а кислые — щелочной краской в синий цвет.

Для получения хорошей освещенности поля зрения конденсор под­нимают до упора, а диафрагму открывают. На мазок наносят каплю иммерсионного масла, объектив погружают в него до соприкосновения с препаратом. Под контролем глаза макровинтом поднимают тубус до Получения изображения. Четкости его добиваются с помощью микро­винта. По нижнему и верхнему краю мазка сосчитывают по 100 клеток, двигая его по ломаной линии. Считают все встречающиеся лейкоциты, дифференцируя их по видам. Сосчитав 200 клеток, подсчитывают чис­ло лейкоцитов каждого вида и делят на 2, чтобы получить количество их относительно 100 клеток, т, е. процентное соотношение.

5. Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ)

Оборудование:

1) аппарат Панченкова с капиллярами;

2) часовые стекла;

3) часы.

Реактив: 5% водный раствор цитрата натрия.

СОЭ определяют в аппарате Панченкова, который представляет со­бой штатив для установки стеклянных капилляров в вертикальном положснии. Капилляры Панченкова — это пипетки с делениями от 0 (вер­хняя отметка) до 100 мм. На уровне деления 50 нанесена буква "Р" (реактив), а на уровне отметки 0 — буква "К" (кровь). Капилляр про­мывают раствором цитрата натрия, набирают его до метки "Р" и выли­вают на часовое стекло. В этот же капилляр набирают кровь из пальца до метки "К". Из капилляра кровь выдувают в каплю реактива и пере­мешивают. Снова набирают кровь из пальца в этот же капилляр и сме­шивают ее с каплей на часовом стекле. Соотношение реактива и крови— 1:4. Наклонив стекло, набирают цитратную кровь в тот же капилляр до метки 0. Зажав верхнее отверстие капилляра вторым пальцем, выти­рают кровь с кончика и ставят в аппарат Панченкова в строго вертикальном положении.

Оседание эритроцитов происходит в течение часа. За это время эритроциты оседают и над ними в капилляре образуется столбик светло-желтой прозрачной плазмы. Отмечают его высоту, отсчитывая количество миллиметров сверху вниз.

По требованию врача кроме общего анализа крови производят и другие морфологические или физико-химические исследования, в том числе подсчет количества тромбоцитов, ретикулоцитов и др.

Определение количества тромбоцитов

Тромбоциты (кровяные пластинки) могут быть подсчитаны в окра­шенных мазках крови, счетной камере или с помощью автоматическо­го счетчика.

Метод подсчета тромбоцитов в мазках основан на определении ко­личества кровяных пластинок, встречающихся при подсчете 1000 эрит­роцитов. Особенностью приготовления мазка является то, что на месте прокола пальца, не выдавливая крови, наносится капля 14% раствора сульфата магния с целью предотвращения склеивания тромбоцитов.

Определение количества ретикулоцитов

При определении количества ретикулоцитов последние считают вместе с эритроцитами. Иными словами, определяют, сколько незре­лых клеток встречается среди 100 эритроцитов. Особенностью окраски ретикулоцитов является то, что они воспринимают краску только в мо­мент, пока клетка, выведенная из кровеносного русла, еще "жива". В связи с этим для подсчета ретикулоцитов используется специальная краска Алексеева, состоящая из краски Азура, поваренной соли, ли­моннокислого натрия и дистиллированной воды. Такая окраска назы­вается суправитальной.

Методы исследования костного мозга

Методика прижизненной характеристики костного мозга была разработана в 1927 году русским ученым М. И. Аринкиным путем пунк­ции грудины. Грудину прокалывают иглой Кассирского И. А. При по­лучении костного мозга часть набирается в два смесителя: один для подсчета ядерных элементов костного мозга (миелокариоцитов), а другой

— для подсчета мегакариоцитов.

Из остального материала делают мазки так же, как и для подсчета клеток периферической крови.

Подсчет ядерных элементов костного мозга проводится в камере Го-ряева. При этом соблюдаются все условия, что и при исследовании количества лейкоцитов в периферической крови. Подсчет мегакариоцитов производится в камере Фукса-Розенталя трехкратно. Среднее арифметическое делится на 3,2 (соответственно объему камеры) и ум-ножается на 20 (степень разведения).

Миелограмма — процентное соотношение клеточных элементов костного мозга.

Миелокариоциты — ядросодержащие элементы костного мозга. В норме их содержание 100-150Х10⁹ г/л.

Лейко-эритробластическое соотношение — отношение элементов .„-белрго и эритробластического ряда. В норме 4 (3):1.

Костно-мозговой индекс созревания нейтрофилов — это отноше­ние молодых гранулоцитарных элементов к зрелым нейтрофилам:

промиелоциты + миелоциты + метамиелоциты _ костно-мозговой индекс

палочкоядерные + сегментоядерные ^— созревания нейтрофилов Это соотношение в норме равно 0,6 — 0,8.

Морфология и функциональные особенности клеток костного

мозга и периферической крови

Гранулоцитопоэз

Миелобласт является родоначальной клеткой элементов гранулоцитарного ряда, берет свое начало от клетки-предшественницы миелопоэза. Диаметр его от 12 до 22 мкм. Клетки эти отличаются нежной структурой ядер с равномерным распределением хроматиновых нитей, образующих тонкопетлистую сеть. Ядра содержат 2-5 ядрышек, окра­шенных в синий цвет. Цитоплазма базофильна в виде узкого ободка, содержит зернистость, не всегда отчетливо видимую.

Промиелоцит достигает в диаметре 27 мкм и считается самой боль­шой клеткой гранулоцитопоэза. Форма клетки чаще округлая, ядро имеет нежную структуру, однако плотнее, чем ядро миелобласта. Ядерно-ци-топлазматическое отношение среднее. Цитоплазма базофильна. В за­висимости от характера единичных специфических гранул различают промиелоциты нейтрофильные, эонофильные и базофильные.

Промиелоциты делятся З раза; промиелоциты 1,2 и 3-го деления отличаются друг от друга размером клетки (увеличивается от 1 к 3-му), плотностью азурофильных гранул (увеличивается), базофилией цитоп­лазмы (уменьшается), числом специфической зернистости (появляет­ся).

Миелоцит является последней клеткой гранулоцитарного ядра, об­ладающей способностью к ролиферации. Размер клетки 10-20 мкм.

Ядерно-цитоплазматическое отношение сдвинуто в пользу ядра. Ядр

опрчкообразное или овальное, имеет более грубую структуру хроматина, чумядро промиелоцита. Ядрышки можно увидеть редко. Цитоплазма розово-фиолетового цвета, зернистость нейтрофильная, эозинофильная, базофильная.

Метамиелоцит не способен к пролиферации и относится к классу созревающих клеток. Это клетка круглой формы, размером 10-15 мкм» Ядерно-цитоплазматическое отношение 1:1. Различают нейтрофильные, эозинофильные и базофильные метамиелоциты. . ;

Палочкоядерные и сегментоядерные гранулоциты отличаются количеством сегментов, из которых состоит ядро (у последних наблюда­ется 2-5 сегментов). По виду зернистости в цитоплазме они бывают нейтрофильные, эозинофилыиде и базофильные.

Функции нейтрофилов:

-фагоцитоз;

- регуляция процессов метаболизма и различных функций организма;

- из специфической зернистости этих клеток был выделен белок, вызывающий стаз в капиллярах и повышение проницаемости;

- выделение пирогена, повышающего температуру организма;

- регуляция микроциркуляции и тканевой трофики, а также интенсивности обмена веществ в органах.

Функции эозинофилов:

— переваривание иммунных комплексов основная функция;

— фагоцитоз. Однако фагоцитарная активность к бактериям более низкая, чем у нейтрофилов.

— участие в обмене гистамина;

-образование антитоксинов, обезвреживающих продукты жизне­деятельности бактерий.

Функции базофилов:

- непосредственное участие аллергических реакциях, фиксация на своей поверхности антител-реагинов, клетка депо биологически ак­тивных веществ (БАВ).

- содержат фактор, активирующий тромбоциты и способствующий их агрегации.

Эритроцитопоэз

Первой морфологически различимой клеткой в ряду эритропозза является эритробласт.

Эритробласт имеет диаметр 20-25 мкм, округлое ядро с нежной структурой, содержащее 1-3 ядрышка. Ободок цитоплазмы насыщенно синего цвета.

Пронормоцит (пренормобласт) — мало отличается от эритробласта по размеру, имеет более грубую структуру ядра, ядрышки в светоовтическом микроскопе выявляются. Цитоплазма базофильна.

Нормоцит (нормобласт) базофильный имеет диаметр16-18мкм. Ядро характеризуется радиальной структурой ("колесовидное ядро"), Цитоп­лазма узкая, базофильная.

Нормоцит полихроматофильный. Размер клетки 9-12 мим. Ядро так­же имеет колесовидную структуру. Характерный приэнак этой клетки— полихроматофильная окраска цитоплазмы, зависящая от начинаю­щейся гемоглобинизации клетки.

Нормоцит оксифильный имеет размер 7-10 мкм, небольшое округ­лое темное ядро с плотным хроматином. Цвет цитоплазмы розовый. Ядерно-плазматическое отношение низкое (до 0,25). Митотическая активность эритроидных клеток снижается по мере созревания. Ми­тозы оксифильных нормоцитов не наблюдаются.

Ретикулоцит — это эритроцит, содержащий базофильный компо­нент, выпадающий при суправитальной окраске и виде сеточки — ретикулума. Размеры его 9-11 мкм. При выходе из костного мозга ретикулоцит превращается в эритроцит.

Эритроцит имеет форму двояковогнутого диска. Средний диаметр его 7,2 — 7,8 мкм, объем 88 мкм³, толщина 2 мкм. Метаболизм эритро­цита существенно отличается от метаболизма ретикулоцита. Эритро­циты не синтезируют белок, липиды, гем, не способны осуществлять полный цикл Кребса и окислительное фосфорилирование.

Функции эритроцитов:

— перенос кислорода к тканям при помощи гемоглобина;

— биосинтез глутатиона;

— адсорбция аминокислот, липидов, токсинов;

— регуляция кислотно-щелочного равновесия;

— эритроциты выделяют в сыворотку крови эритроцитарный кейлон, который оказывает подавляющее действие на эритропоэз;

— в эритроцитах обнаружен эритроцитарный антикейлон, стиму­лирующий эритропоэз.

Мегакариоцитопоэз

Мегакариобласт— самая незрелая форма, наименьшая по размерам (диаметр 25-35 мкм), с высоким ядерно-цитоплазматическим отноше­нием, нежной структурой ядра и базофильной цитоплазмой без зерни­стости.

Промегакариоцит размером 30-50 мкм. Структура ядра более гру­бая. В базофильной цитоплазме наблюдается азурофильная зернистость и возможна отшнуровка цитоплазмы.

Мегакариоцит — гигантская клетка костного мозга, диаметр ее 50-80 мкм. Ядро многлопастное, структура ядра грубая, нередко наблюда­ются явления пикноза. Ядерно-цитоплазматическое отношение сдви­нуто в пользу цитоплазмы, которая светло-голубого цвета и содержит обильную зернистость разных оттенков. В клетках можно наблюдать отделение от цитоплазмы готовых кровяных пластинок (отшнуровку).

Особенностью кинетики мегакариоцитов является отсутствие деления во всем ряду, и популяция, следовательно, увеличивается только за счет поступления морфологически нераспознаваемых клеток — пред­шественников костного мозга.

Функции тромбоцитов:

— фиксация на своей поверхности антител и перенос их по назна­чению;

— уменьшение проницаемости капилляров;

— адгезия;

— агрегация;

— способность поддерживать спазм поврежденных сосудов;

— трофика эндотелиоцитов;

— участие в гемостазе.

Моноцитопоэз

Среди костномозговых предшественников моноцитов морфологически можно определить только монобласты и промоноциты.

Монобласт имеет диаметр около 18 мкм. Ядро клетки рыхлое, со­держит 1-3 ядрышка. Цитоплазма базофильная, без зернистости, ок­ружает ядро равномерной, узкой каймой.

Промоноцит имеет диаметр примерно 15 мкм, крупное ядро округ­лой или слегка бобовидной формы без млрышек. Цитоплазма менее базофильна, чем у монобласта,

Моноциты. Размер клеток 14-20 мкм. Ядро может быть различной формы: округлой, почкообразной, бобовидной, подковообразной, с дву­мя или тремя лопастями. Ядрышки не обнаруживаются. Цитоплазма широкая серо-голубого цвета. Функции моноцитов:

— фагоцитоз;

— участие в реакциях гуморального и клеточного иммунитета;

иммунный надзор за опухолевым ростом;

— участие в метаболизме ряда биологически важных продуктов, включая трансферрин и интерферон;

— выделение пирогена, повышающего температуру организма;

— образование фактора, стимулирующего рост гранулоцитов и мак-рофагов

Лимфоцитопоэз

Лимфобласт является родоначальной клеткой для лимфатического ряда. Его размеры достигают 20-22 мкм. Округлое ядро имеет нежно-сетчатое строение и правильное равномерное распределение хромати-ЭЮвых нитей. В ядре видны 1-3 ядрышка. Цитоплазма базофильная.

Пролимфоцит размером 11-12 мкм. Структура ядра уже грубая, от­четливо видны 1-2 нуклеолы. Цитоплазма пролимфоцита не отличает­ся от цитоплазмы лимфоблиста, лимфоциты имеют размер 7-9 мкм. Широкоцитоплазменные лимфоциты могут достигать 12-13 мкм в диаметре. Ядро округлой формы, компактное, глыбчатой структуры. Цитоплазма базофильная.

Функции лимфоцитов;

— осуществляют реакции клеточного и гуморального иммунитета.

Плазмоцитопоэз

Будучи производным В-лимфоцитов, плазматический ряд клеток проходит несколько стадий от плазмобласта через проплазмоцит до плазмоцита.

Плазмобласты — размер клеток 16-20 мкм. Ядро имеет нежную структуру с ядрышками. Цитоплазма интенсивно базофильная.

Проплазмоциты размером до 20 мкм. Ядро нежной структуры со­держит 1 ядрышко, расположено эксцентрично. Цитоплазма удлинен­ная, резко базофильная, иногда с фиолетовым оттенком.

Плазмоциты размер от 8 до 20 мкм. Ядро круглой или овальной формы, имеет трубую колесовидную исчерченность и располагается эксцентрично.- Помимо одноядерных плазмоцитов можно видеть двух-

и четырехядерные плазматические клетки. Цитоплазма интенсивно ба­зофильная.

Функции плазмоцитов:

- Осуществляют синтез иммуноглобулинов.