Подсчет форменных элементов крови

Количество эритроцитов и лейкоцитов подсчитывается в 1 мм³ крови, а количество кровяных пластинок определяется на тысячу подсчитанных эри­троцитов.

Кровь для подсчета может быть взята как из артерии, так и из вены. Сравнение показателей крови из артерий и вен у сельскохозяйственных животных, проведенное Даниловым, показало, что количественной разницы между соответствующими форменными элементами крови артерий и вен не имеется.

Принцип подсчета. Даже в маленькой капле крови форменные элементы тесно прилегают друг к другу, делая невозможным их подсчет. Для подсчета их необходимо разъединить, сделать промежутки между ними настолько боль­шими, чтобы форменные элементы не налегали один на другой. Для этой цели используются изотонические растворы, в которых форменные элементы сохра­няют свою форму, и измерительные трубки, позволяющие отмеривать неболь­шое, но точное количество крови и растворителя. Разведенная кровь поме­щается дальше в специальные счетные камеры, в которых и производится подсчет форменных элементов.

Смесители, или меланжеры, представляют собой капиллярные трубочки око­ло 10 см длиной, с шаровидным или грушевидным расширением, внутри которо­го находится стеклянный! шарик, способствующий лучшему смешиванию. На капиллярной части смесителя нанесены деления, обозначенные цифрами 0,5 и 1,0, а за расширением на трубочке—101 или 11. Смеситель с меткой 101 пред­назначается для подсчета эритроцитов, а с меткой 11—для лейкоцитов. Резер­вуар эритроцитарных смесителей в 10 раз больше, чем у лейкоцитарных. На смеситель надевается резиновая трубочка с костяным или стеклянным мунд­штуком. Кровь насасывается ртом. В 'смесителях Паппенгейма кровь насасы­вается при помощи поршня, который находится на расширенной части сме сителя.

Разведение для подсчета эритроцитов делают из расчета 1 : 100 или 1 : 200, а для лейкоцитов 1 : 10 или 1 : 20.

Для подсчета эритроцитов используется раствор поваренной соли 0,9%, 3%-ный раствор (Фрейфельд), или жидкость Гайема (сулемы 0,1, хлористого натрия 1,0, сернокислого натрия 5,0 и дистиллированной воды 200,0).

Можно также использовать жидкость ИПК (хлористого натрия 7,0, хло­ристого калия 0,2, лимоннокислого натрия 5,0, сернокислой магнезии 0,04 и дистиллированной воды 1000,0).

Для подсчета лейкоцитов употребляется 1 %-ный раствор уксусной кислоты с примесью краски (3—4 капли 1%-ного раствора генцианвиолет).

Для подсчета лейкоцитов у кур используется изотонический раствор, подкрашенный генцианвиолетом.

Кровь и растворяющая жидкость набираются точно до соответствующей метки. При наполнении смесителей необходимо следить,за тем, чтобы во время насасывания крови или разводящей жидкости не попадали пузырьки воздуха.

Когда смеситель наполнен кровью и соответствующей жидкостью, концы его зажимают между большим и указательным пальцами и несколько раз энергично встряхивают, заставляя перекатываться шарик в резервуаре для смешивания крови с жидкостью. Перемешивание жидкости повторяется перед заряжением камеры до получения равномерной мутной жидкости (гомогенной взвеси).

Счетные камеры. Первая счетная камера была сконструирована в 1884 г. Алферовым. Эта камера не получила распространения и в дальнейшем была видоизменена Бюркером.

Счетные камеры представляют собой толстое предметное стекло, на кото­ром укреплены три стеклянные пластинки; на одной из них нанесена сетка. Имеются также камеры из цельного стекла. В камерах типа Бюркера средняя пластинка разделена желобком на две половины, на каждой из которых выгравировано по сетке.

Средняя пластинка, на которой нанесена сетка, ниже боковых пласти­нок на 0,1 мм. Если на боковые пластинки наложить покровное стекло, то между ними и средней пластинкой образуется щель, равная 0,1 мм. В эту щель и вводится кровь для подсчета форменных элементов.

Чтобы высота камеры не изменялась, покровное стекло или притирается, или же прижимается с помощью специальных клемм. Критерием плотного прилегания покровного стекла слу­жит появление радужных колец (кольца Ньютона).

Рис. 82. Смесители:

1—для эритроцитов; 2—для лейко-цитов.

Рис. 83. Счетные камеры:

А—камера Горяева; Б—Тома—Цейса

В— Бюркера.

После тщательного перемешивания крови в смесителе и удаления 3—4 ка­пель на фильтровальную бумагу, кровь в виде маленькой капли вносится под покровное стекло. В силу капиллярности капля втягивается в просвет между пластинками. Величина капли должна быть такой, чтобы она покры­вала всю среднюю пластинку, на которую нанесена сетка, но не выступала за боковые пластинки и покровное стекло.

Заряженная камера помещается на столик микроскопа и устанавливается так, чтобы деления сетки и форменные элементы, лежащие на ней, были отчет­ливо видны. После того как форменные элементы осядут и станут отчетливо видны на фоне сетки, приступают к подсчету.

Сетки в счетных камерах различных авторов неодинаковы как по рисунку, так и по площади.

Предтеченский предложил оригинальную сетку, общей площадью 4 мм² Вся сетка Предтеченского разбита на 100 больших квадратов, из которых 25 разделены на 16 маленьких квадратиков, 50 разбиты на прямоугольники и 25 являются чистыми. Сторона маленького квадрата равна 1/20 мм, а площадь1/400 мм.

Подсчет эритроцитов производится в пяти больших квадратах, разбитых на 16 малых, а лейкоциты подсчитываются на площади всей сетки.

Положительной стороной сетки Предтеченского является то, что большие квадраты, разделенные на малые, четко отграничены один от другого, что позволяет сосредоточиться только на одном большом квадрате. Положительным является и то, что сетка размещена на большой площади (4 мм²).

Рис. 84. Сетка Предтеченского.

К недостаткам этой сетки относится то, что приходится подсчитывать лейкоциты на площади всей сетки, как в чистых квадратах, так и в квад­ратах, разделенных на малые квадраты и пря­моугольники, что несколько затрудняет работу. Принцип Предтеченского в построении сетки в 1910 г. был использован Горяевым, который увеличил размер сетки до 9 мм².

Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов, из которых 25 разделены на 16 малых, 100 на прямоугольники и 100 остают­ся чистыми.

Каждая из 15 вертикальных и горизонталь­ных полос сетки Горяева имеет ширину равную ⁴/₂₀ мм, причем каждая третья полоса, в свою очередь, разделена на четыре узкие полоски шириной в 1/20 пересечением которых обра­зуются маленькие квадратики с площадью в ¹/₄₀₀ мм². Они группируются по 16, образуя 25 таких групп.

Рис. 85. Сетка Горяева.

Для подсчета эритроцитов используются большие квадраты, разделенные на 16 маленьких. Эритроциты подсчитываются в пяти таких квадратах, рас­положенных по диагонали. При анемии количество квадратов при подсчете должно быть увеличено. Чем больше количество больших квадратов, тем ближе к истине будет результат подсчета эри­троцитов.

Подсчет лейкоцитов можно проводить в больших чистых квадратах, которые полностью помещаются в поле зрения микроскопа.

При высоком содержании лейкоцитов Горяев рекомендует считать их в группах по три квадрата в 1/25 мм или даже по отдельным квад­ратам, в последнем случае выгоднее пользо­ваться теми же квадратами, что и для счета эритроцитов.

Положительной стороной сетки Горяева яв­ляется отчетливость рисунка, а отсюда лег­кость и удобство ориентировки при подсчете, резкая отграниченность больших квадратов, раз­деленных на 16 малых, и большая площадь сетки по сравнению с сеткой Предтеченского. В по­следнее время камера с сеткой Горяева в Советском Союзе получила широкое распространение.

Из сеток зарубежных авторов наибольшее распространение получили сетки Тома, Бюркера и Тюрка. Первые две являются оригинальными, в то время как последняя представляет сочетание сетки Тома и сетки Бюркера, наложенных одна на другую.

Сетка Тома нанесена в виде большого квадрата, разделенного тройными линиями на 16 средних, квадратов. Каждый из 16, в свою очередь, простыми линиями делится на 16 маленьких квадратиков. Всего таких маленьких квад­ратиков в сетке 400. Вся сетка по площади равна 1 мм². Каждая сторона сетки разделена на 20 равных частей. Боковая сторона малого квадрата сетки имеет 1/20*1/20=1/400 мм₂. Так как высота в камере равна 1/10 мм, то объем крови в 1 малом квадрате определяется ¹/₄₀₀₀ мм³.

Рис. 86. Сетка Тома.

Недостатком сетки следует считать то, что квадраты отграничены только тройными линиями, что не дает возможности сосредоточиться на одном большом квадрате, затрудняя тем самым подсчет. Кроме того, площадь этой сетки мала. Сетка Бюркера в этом отношении стоит несколько особняком. Малые квадраты не собраны в группы, а равномерно распределены по всей сетке. Сетка Бюркера равна 9 мм². Она состоит из 144 больших квадратов по 12 в каж­дом ряду. Между большими квадратами распо­лагаются малые квадраты по 13 в каждом ряду. Высота камеры 1/10 мм, площадь большого квад­рата равна ¹/₂₅ мм² и малого ¹/₄₀₀ мм². Сетка Бюркера удобна для подсчета лейкоцитов и менее пригодна для подсчета эритроцитов.

Техника подсчета эритроцитов. Если кровь хорошо размешана в смесителе и камера заряжена правильно, то эритроциты распределяются по сетке равномерно. Если эритроциты лежат не­равномерно, в одних квадратах их больше, а в других меньше, то имеются погрешности или в технике смешивания в смесителе, или в заря­жении камеры. Стекание на одну сторону воз­можно при неправильном уровне стола. Вот по­чему рекомендуется установить стол по уровню.

Рис. 87. Сетка Бюркера.

Подсчет эритроцитов производится в больших квадратах, разделенных на 16 маленьких квадратов. При ориентировочном подсчете можно ограни­читься пятью большими квадратами. Для получения более точных цифр, необ­ходимо подсчитать 10 и даже больше больших квадратов. Проверочные под­счеты, проведенные Маточкиным, показывают, что чем меньше подсчитывается больших квад­ратов, тем больше бывают отклонения показате­лей по сравнению с 16 квадратами сетки Тома. В целях избежания повторной записи одной и той же клетки рекомендуется придерживаться одной какой-нибудь методики подсчета. Подсчет эритроцитов начинают обыкновенно с маленького квадрата, расположенного в левом углу большого квадрата, затем переходят ко второму, третьему и четвертому того же ряда. Сосчитав клетки пер­вого ряда, переходят на второй и считают в обратном порядке. Меняя с каждым рядом на­правление, заканчивают подсчет в левом нижнем квадратике первого большого квадрата и перехо­дят на второй большой квадрат. Существует два метода подсчета эритроцитов в большом квадрате с целью избежания повторной записи.

Один метод предусматривает подсчет всех эритроцитов, лежащих внутри квадрата и на его левой и верхней линиях. Клетки, лежащие на правой и ниж­ней линиях, подсчитываются с другими квадратами. В крайних правых квад­ратах как верхних, так и нижних клетки, лежащие на правой и нижней ли­ниях, подсчитываются с последними квадратами. Этот метод предусматривает подсчет только тех клеток, которые лежат на линиях и прилегают к ним с внут­ренней стороны, без учета клеток, находящихся вне квадрата.

Второй метод предусматривает подсчет в том же порядке, но отличается тем, что учитываются клетки, прилегающие снаружи отграничивающих линий. В этом случае подсчет ведется без учета правых и нижних отграничивающих линий.

Мы разделяем точку зрения большинства медицинских авторов, что первый метод подсчета является более точным.

Зная площадь, на которой произведен подсчет эритроцитов, высоту камеры и степень разведения, можно легко определить количество их в 1 мм³.

При вычислении количеств эритроцитов в 1 мм³ можно использовать сле­дующую формулу:

Х = АС / ПВ

где X—искомое количество эритроцитов в 1 мм³;

А—количество подсчитанных клеток;

С—разведение;

П—количество подсчитанных малых квадратов;

В—емкость одного малого квадрата (¹/₄₀₀₀ мм³).

При подсчете в 10 больших квадратах эта формула при вычислении будет выглядеть так:

Х = А*4000*200 (или 100) / 160

Расчет производится следующим образом: каждая сторона малого квад­рата равна ¹/₂₀ мм, высота камеры—¹/₁₀мм. Таким образом, объем 1 маленького квадрата равен ¹/₂₀х¹/₂₀Х¹/₁₀=¹/₄₀₀₀мм³. Умножая на разведение (100 или 200), а также на количество клеток, полученное при подсчете, а затем, разделив на количество подсчитанных малых квадратов, получают количество эрит­роцитов в 1 мм³.

Количество эритроцитов у домашних животных подвержено известным колебаниям в зависимости от вида, возраста, породы, пола и некоторых других факторов.

	в	1 мм3 крови в	млн.
Вид животного	среднее	минимальное	максималь­ное	Фамилия автора
Крупный рогатый скот . . Яки Буйволы Верблюды Северные олени Лошади Собаки Морские свинки Куры	6,0 9,4 13,1 7,1 6,0 13,6 10,0 8,0 5,5 6,2 5,7 6,7 7,4 6,9 5,7 3,5 3,3 3,0	5,5 8,0 10,3 5,3 5,3 11,1 9,0 6,0 5,0 5,1 3,4 5,0 6,6 5,5 4,8 2,0 2,8 2,0	7,2 11,2 18,8 10,3 7,1 15,8 14,0 11,5 7,0 6,8 7,9 8,7 9,4 7,9 6,7 5,0 4,0 3,7	Д. Соколов Л. Лебедев B. Чагин П. Карасев К. Мавсун-Заде Н. Семушкин А. Неводов C. Хрусталев А. Неводов А. Неводов С. Смирнов Ф. Михайлов А. Неводов A. Васильев Д. Криницын B. Зайцев C. Веремейчик П. Преображенский

При патологических процессах количество эритроцитов может быть уве­личено (эритроцитоз) и уменьшено (олигоцитемия).Эритроцитозы встречаются сравнительно редко. Причиной эритроцитозов может быть сгущение крови вследствие потери воды организмом. Они могут возникать при сильных поно­сах, в момент образования экссудатов и транссудатов, обильном потоотде­лении, распространенных отеках и в начальной стадии развития инфекционных и лихорадочных процессов. Особенно значительные эритроцитозы отмечаются при непроходимости кишечника у лошади. Количество эритроцитов в этих случаях повышается до 12—14 миллионов, а гемоглобин увеличивается до 100 и даже больше.

Олигоцитемии различной степени выраженности отмечаются при забо­леваниях, сопровождающихся распадом эритроцитов, при инфекциях и инток­сикации. Резкое снижение эритроцитов отмечается при кровепаразитарных заболеваниях—пироплазмозе, нутталиозе и трипанозомозе. Особенно значи­тельные олигоцитемии обнаруживаются при инфекционной анемии лошадей и являются одним из симптомов клинической картины этого заболевания.

Техника подсчета лейкоцитов. При подсчете лейкоцитов используются те же камеры, что и для подсчета красных кровяных телец, смеситель для лейкоцитов, резервуар которого в 10 раз меньше эритроцитарного, и жидкость Тюрка, назначение которой гемолизировать эритроциты и окрасить лейко­циты с тем, чтобы обеспечить точность подсчета. Обычно для этой цели исполь­зуется раствор уксусной кислоты, подкрашенный раствором генцианвиолет.

В камере с сеткой Горяева лейкоциты подсчитываются в 100 больших квадратах, общей площадью 4 мм².

В камере с сеткой Тома подсчитываются все 400 малых квадратов на общей площади 1 мм².

Наиболее точные результаты получаются при подсчете в камере с сеткой^ Горяева вследствие большой площади, а отсюда и большого количества со­считанных клеток. Вычисление производят по формуле:

Х = А*4000*20(10) / С

где X—искомое количество клеток в 1 мм³;

А—количество подсчитанных клеток; 74000—емкость одного квадратика (¹/₂₀ X ¹/₂₀X ¹/₁₀ = ¹/₄₀₀₀); 20—разведение;

С—количество подсчитанных малых квадратов. При патологических процессах можно отметить как увеличение лейко­цитов (лейкоцитоз), так и уменьшение по сравнению с нормой (лейкопения).

Лейкоцитоз встречается практически очень часто при многих инфекциях и интоксикациях и свидетельствует о раздражении лейкопоэтической части кроветворных органов.

Лейкопения встречается реже и может свидетельствовать или об угне­тении кроветворных органов, или об истощении их.

Техника подсчета кровяных пластинок. Подсчет кровяных пластинок производится по методу Фонио, несколько измененному Негели. Чтобы избе­жать коагуляции пластинок, прокол кожи делается через нанесенную на кожу каплю раствора 14%-ной сернокислой магнезии. Выступившая из ранки кровь смешивается с раствором, что предотвращает коагуляцию. После смешивания крови с сернокислой магнезией краем покровного стекла берут капельку этой смеси и делают мазок на предметном стекле.

Приготовленный мазок высушивают на воздухе и фиксируют специальной смесью следующего состава: сулемы 0,1, ледяной уксусной кислоты 6 капель, абсолютного спирта 100 мл. Окраска производится по методу Романовского— Гимза или по Паппенгейму в течение 1—2 часов. Последняя окраска дает очень демонстративные результаты.

При подсчете определяется, какое количество кровяных пластинок при­ходится на 1 000 эритроцитов. Подсчет производится с помощью специаль­ного окулярного окошка, которое, суживая поле зрения, облегчает подсчет и делает его более точным.

Вначале в каждом поле зрения подсчитываются все эритроциты, а затем-кровяные пластинки. Для подсчета лучше брать четыре разных участка мазка, так как при неравномерном распределении эритроцитов может быть значительная ошибка в подсчете кровяных пластинок. Запись эритроцитов и кровяных пластинок производится раздельно, по следующей схеме:

1-е поле 2-е поле 3-е поле 4-е поле

Эритроциты 250 250 250 250

Кровяные пластинки 15 18 18 16

Зная общее количество эритроцитов у данного пациента, нетрудно произ­вести перерасчет и определить, какое количество кровяных пластинок нахо­дится в 1 мм³. Если количество кровяных пластинок на 1 000 подсчитанных эритроцитов равно 67, а количество эритроцитов в 1 мм³ равно 7 000 000, то

Х = 7000000*67 / 1000

У здоровых животных количество тромбоцитов в 1 мм³ (в тысячах) равно: у лошади 200—900; крупного рогатого скота 260—710; овцы 170—980; козы 310—1 020; свиньи 130—450; собаки 190—577; кролика 125—250; курицы 22—41.

При патологических процессах количество кровяных пластинок увели­чивается (тромбоцитоз) и может уменьшаться (тромбоцитопения).

Увеличение количества тромбоцитов у животных отмечается при ряде инфекционных заболеваний, таких, как инфлюэнца лошадей, плеврит, гемоглобинемия и саркоматозные поражения.

Уменьшение количества тромбоцитов отмечается при инфекционной анемии лошадей, кровепятнистой болезни и некоторых других болезнях.

Особенно большое значение тромбоцитопения имеет при стахиботрио-токсикозе лошадей. По данным Синева, количество кровяных пластинок сни­жается задолго до появления изменений со стороны белой крови. По мере развития процесса, количество их постепенно уменьшается. Незадолго до перехода из скрытой фэрмы в септическую количество тромбоцитов падает до минимума. Если у здоровой лошади количество тромбоцитов на 3 000 эритро­цитов равно в среднем 50, то при стахиботриотоксикозе количество их умень­шается до 8—5—3 на 3 000 эритроцитов. Одновременно можно обнаружить резко выраженную лейкопению и лимфоцитоз (до 90%), с уменьшением грану-лоцитов. Со стороны плазмы отмечается полная ирретрактильность кровяного сгустка.

Тромбоцитопения, следовательно, может расцениваться наравне с изме­нениями ретракции кровяного сгустка и использоваться для выделения боль­ных лошадей до перехода процесса в септическую форму.