Резистентность эритроцитов у здоровых животных

Вид животного	Минимальное	Максимальное	Фамилия автора
Крупный рогатый скот ....	0,74—0,64	0,46—0,42	Д. Соколов
Овцы	0,80—0,76	0,50—0,46	Л. Лебедев
Козы	0,77—0,63	0,59—0,47	В. Чагин
Яки	0,60—0,56	0,48—0,42	П. Карасев
Лошади	0,62—0,52	0,44—0,38	С. Хрусталев и В. Сидоров
Свиньи	0,86—0,78	0,48—0,42	С. Смирнов
Собаки	0,58—0,54	0,41—0,33	Ф. Михайлов
Кошки	0,64—0,60	0,50—0,42	Баранов
Кролики	0,46—0,42	0,34—0,32	А. Васильев

щей гипотонии. Если норма, например, равна 0,6, то отклонение в сторону 0,7—0,8 будет указывать на понижение резистентности, а в сторону 0,4— 0,3, напротив,—на повышение резистентности.

В основе всех рекомендуемых методов положен принцип: менее стойкие эритроциты разрушаются в растворах, близких к изотоническим, а наиболее стойкие сохраняются в растворах малой концентрации, в которых большая часть эритроцитов разрушается.

Метод Л им б е к а—Р и б ь е р а. Для определения резистентности эритроцитов используются растворы поваренной соли в концентрации от 0,3 до 0,9% с интервалом в 0,02. Растворы в количестве 1 мл набираются в центри­фужные пробирки. После этого в каждую пробирку добавляется пипеткой от гемометра Сали кровь в количестве 20 мм³. Перемешав жидкость и выждав 10—15 минут, пробирку устанавливают в центрифугу и через 5 минут просмат­ривают результат. В пробирках, где произошел частичный гемолиз, жидкость окрашена в слаборозовый цвет и на дне пробирки имеется значительный осадок. В пробирке с полным гемолизом жидкость окрашивается в вишнево-красный цвет и становится совершенно прозрачной. Легкое желтоватое окрашивание расценивается как показатель начала гемолиза, а слабое покраснение за начало выраженного гемолиза.

Метод Гамбургера. Для определения резистентности эритро­цитов используется сернокислый натрий в концентрации от 0,3 до 0,9% с интер­валом в 0,02. Гемолиз наступает несколько позднее, чем в растворах с поварен­ной солью, которая травмирует оболочку эритроцитов. Для определения резис­тентности по этому методу необходимо иметь пробирки с притертыми пробками. Пробирки с раствором выдерживаются при температуре 14°, а затем центрыфугируются. Оценка результатов такая же, как и по методу с поваренной солью.

Метод Яновского. Учет разрушенных и сохранившихся эритро­цитов производится в счетной камере. Кровь набирают в смесители для подсчета эритроцитов и разводят растворами поваренной соли различной концентра­ции. Подсчет производится через 10 минут после того, как будут заполнены смесители.

Вместо обычного изотонического раствора Зиммель предложил поль­зоваться следующим раствором: 8,2 хлористого натрия, 0,2 хлористого калия, 0,2 хлористого магния, 0,2 хлористого кальция, 0,1 фосфорно-кислого натрия, 0,05 углекислого натрия на 1 литр воды. Этот раствор принимается за основной, из которого готовят дальнейшие разведения—0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3. Эти разведения и используются для определения резистентности эритро­цитов.

Зиммель предложил также суправитальное окрашивание сохранившихся эритроцитов с целью определения количества эритроцитов с гранулофиламен-тозной субстанцией. Это позволяет решить вопрос о том, какие эритроциты являются наиболее стойкими—старые или молодые.

Для суправитального окрашивания 1 %-ный спиртовый раствор бриллиант­крезилбляу наносится на покровное стекло. Вначале определяется количество эритроцитов в основном (изотоническом) растворе, а затем последовательно в растворах убывающей концентрации—0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, с одновремен­ным учетом молодых эритроцитов.

Техника заполнения смесителей и камеры такая же как при обычном под­счете эритроцитов. Подсчет эритроцитов—обычный. Отличным является только окрашивание покровного стекла бриллианткрезилбляу перед наложением его на счетную камеру и учет молодых эритроцитов.

Определение билирубина в сыворотке крови. В незначительном количест­ве билирубин может быть обнаружен в сыворотке крови у здоровой лошади. В значительных количествах билирубин появляется только при патологиче­ских процессах.

Билирубин образуется из гемоглобина распавшихся эритроцитов. В ре­зультате распада образуется два пигмента—гемосидерин, содержащий железо, и гематорфирин. В клетках ретикуло-эндотелиальной системы из этих пигментов образуется билирубин, связанный с глобулинами. Этот билирубин некото­рое время циркулирует в крови, окрашивая сыворотку в желтоватый цвет. Затем он захватывается купферовскими клетками печени и свобождается от белка, после чего становится полноценным билирубином, который поступает в кишечник. Часть пигмента в виде уробилина всасывается в кровь, а часть в виде стеркобилина выводится с фекалием.

При патологии возможно скопление чистого билирубина в крови и выведе­ние его через почки с мочой. Следует отметить, что билирубин, связанный с белком, через здоровые почки не проходит, но его выделение возможно при нефритах.

Билирубин, связанный с белком, называется билирубином, не проведен­ным через печень. Повышенное количество такого билирубина в крови отме­чается при гемолитических желтухах. Чем значительнее гемолиз эритроцитов, тем больше содержится в сыворотке крови билирубина, не проведенного через печень.

Билирубин, не связанный с глобулинами, называется проведенным через печень. Значительное количество такого билирубина в сыворотке крови можно обнаружить при различного рода препятствиях к оттоку желчи в кишечник. Желчь застаивается в выходящих путях и затем начинает поступать в кровь.

Определение билирубина в сыворотке крови является, следовательно, надежным методом дифференциации желтух.

Ван-ден-Берг, разработавший метод дифференциации желтух, разли­чает два вида реакции на билирубин: прямую и непрямую.

Прямой реакцией называется такая, которая возникает после добавления рабочего реактива. Окрашивание жидкости может иметь вариации по времени и интенсивности окраски. Различают реакции прямую, быструю или моменталь­ную, когда жидкость окрашивается сейчас же после добавления реактива; прямую двухфазную, если после добавления реактива жидкость окрашивается очень слабо, а затем окрашивание становится все более и более интенсивным, и прямую замедленную, когда окрашивание появляется спустя 10—15 минут. Прямая реакция получается при наличии в крови билирубина, проведенного через печень. Прямая, быстрая реакция отмечается при механической жел­тухе, возникающей при закупорке желчного протока камнями, паразитами.

Прямая двухфазная реакция бывает при желтухах смешанного характера, а прямая замедленная—при катаральное желтухе с нарушением функции печеночных клеток.

Непрямая реакция возникает после добавления спирта. Она выявляет билирубин, не проведенный через печень и связанный с глобулиновой фракцией. Спирт коагулирует белок и тем самым разрушает связь билирубина с глобули­нами и создает нормальные условия для хода реакции.

Непрямая реакция указывает на гемолитическую желтуху, когда били­рубина бывает больше 3 мг% в 100 мл сыворотки крови.

Для определения билирубина в сыворотке крови рекомендуется несколько методов. По точности результатов на первом месте стоит колориметрический метод Ван-ден-Берга. Он применяется чаще при выполнении научных работ, так как требует лабораторных условий, химически чистых реактивов и коло­риметра Аутенрита или Дюбоска. В клинической практике используются дру­гие методы, например Бакальчука и Херцфельда. Для ориентировочных исследований может быть использован метод Мауленграхта в модификации Синева для животных.

Способ Ван-ден-Берга. Для постановки реакции необходимо иметь колориметр Аутенрита или Дюбоска, диазореактивы Эрлиха, 96%-ный спирт и стандартный раствор.

Рабочая смесь готовится из разных диазореактивов. Первый реактив— сульфаниловой кислоты 1,0, соляной кислоты 15 мл (уд. вес 1,125) и дистиллиро­ванной воды 1 литр. Второй—азотистокислого натрия 0,5 и дистиллированной воды 100 мл. Рабочий реактив готовится в соотношении 8 мл первого реактива и 0,25 мл второго.

Наилучшим и наиболее употребительным является кобальтовый стандарт. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 2,161 г сернокислого кобальта, предварительно освобожденного от кристаллизационной воды путем нагрева­ния. Можно также взять 3,92 г кристаллического CoS0₄*7H₂0. Этот раствор соответствует раствору билирубина 1:200 000 (0,5 мг%).

Раствором такой же окраски, но менее стойким, является раствор, полу­ченный следующим образом: 1) в колбочке емкостью в 100 мл, растворяют 0,1508 железо-аммиачных квасцов в небольшом количестве воды, прибавляют затем 50 мл соляной кислоты (удельный вес 1,19) и доводят после этого водой уровень жидкости до метки 100. Из этого основного раствора, имеющего 1/320 нормальности, приготовляют рабочий реактив (1/8000). В колбу емкостью 250 мл вносят 10 мл основного раствора, смешивают с 25 мл соляной кислоты и доливают до 250 мл водой. Рабочий реактив годен для работы в течение нескольких месяцев; 2) 10%-ный раствор роданистого калия или аммония.

Приготовление стандартного раствора. К 3 мл рабочего реактива прибав­ляется в делительной воронке 3 мл 10%-ного раствора роданистого калия и 12 мл сернокислого эфира. При постоянном охлаждении делительной воронки под краном, жидкость смешивают до тех пор, пока роданистое железо не будет экстрагировано эфиром. Этим розовым эфирным раствором роданистого железа и пользуются для сравнения в качестве стандарта. Раствор нужно предохра­нять от испарения. По своей окраске стандарт соответствует 0,5 мг билирубина на 100 мл сыворотки крсви.

Техника исследования сводится к следующему: К 2 мл испытуемой сыво­ротки добавляют 4 мл спирта и смесь центрифугируют в течение 20 минут; 1 мл раствора переносят в клин колориметра Аутенрита или стаканчик коло­риметра Дюбоска и прибавляют 0,5 мл рабочего реактива.

Наполнив затем второй стаканчик колориметра кобальтовым стандартом или раствором роданистого железа, сравнивают окраску обоих растворов и устанавливают, на каких делениях шкалы получается идентичное окрашивание в обоих стаканчиках. Расчет производится по формуле:

С₂= C₂*H₂*5 / H₁ мг в 100 мл сыворотки.

C₁—концентрация исследуемой жидкости;

С₂—концентрация стандартного раствора;

Н₁—высота столба исследуемой жидкости;

H₂—высота стандарта.

При расчетах необходимо учитывать степень разведения сыворотки.

При наличии билирубина получается розовое окрашивание, но нужно учесть что окрашивание зависит от реакции среды. В нейтральной среде окра­шивание получается розовое, в слабокислой—эта окраска имеет слабосиневато-фиолетовый оттенок. Такая же окраска получается и при медленном проведе­нии пробы.

Метод Бакальчука. Для постановки пробы используются диа-зореактивы (см. метод Ван-ден-Берга), из которых готовится рабочая смесь в пропорции: 10 мл реактива № 1 и 0,3 мл реактива № 2.

Для определения билирубина берется пять пробирок; в них наливают по 0,5 мл физиологического раствора, а затем в первую вносят 0,5 мл испытуемой сыворотки. Перемешав жидкость, отсасывают при помощи пипетки 0,5 мл смеси и переносят ее во вторую пробирку. Из второй после перемешивания смеси переносят 0,5 мл в третью и т. д. Излишек в пятой пробирке отсасывается и выливается в чашку. В результате получается разведение кратное 2, 4, 8, 16, 32.

В каждую из пробирок вносят затем по 0,5 рабочего реактива и осторожно смешивают. При наличии билирубина получается розовое окрашивание. Кон­цом реакции считается разведение, в котором едва различимо розовое окраши­вание.

Если окрашивание не наступило в течение 15 минут, в пробирки добавляют спирт. Помутневшая вследствие осаждения белка жидкость при наличии били­рубина окрашивается в розовато-малиновый цвет. Чтобы лучше заметить в мутной жидкости изменение цвета, рекомендуется добавить по 0,5 мл эфира и рассматривать на белом фоне. Разница между бесцветным слоем эфира и окра­шенной испытуемой жидкостью выступает очень отчетливо. Умножив разведе­ние на 0,016, устанавливают количество билирубина в 1 мл. Умножением на 100 получают количество билирубина в миллиграммах на 100 мл сыворотки.

Методом Бакальчука можно определить, кроме количества билирубина, разновидность его. Появление окрашивания после добавления рабочего реакти­ва говорит в пользу билирубина, проведенного через печень (прямая реакция) изменение цвета после добавления спирта свидетельствует о наличии билиру­бина, не проведенного через печень (непрямая реакция).

Метод Херцфельда. В качестве реактива используется смесь 19 частей 25%-ной соляной кислоты и 1 часть 25%-ной азотной кислоты. Этот основной раствор отличается стойкостью и хорошо сохраняется в продолжение длительного времени.

Перед постановкой опыта каждый раз готовят рабочий реактив, состоящий из 1 части реактива и 4 частей 96° спирта.

Для определения билирубина берут шесть пробирок. В первую пробирку наливают 1 мл испытуемой сыворотки, а в остальные пять—по 0,5 мл физиоло­гического раствора. Затем 0,5 мл сыворотки из первой пробирки переносят во

вторую. Перемешав жидкость, отстаивают 0,5 мм смеси и переносят в третью и т. д. Излишек в 0,5 мл в последней пробирке отстаивается и удаляется, Приготовив таким образом ряд разведений, в каждую пробирку вносят по 0,5 мл рабочего реактива.

При наличии билирубина получается окрашивание жидкости в зеленый цвет, который постепенно теряет свою интенсивность по мере разведения сы­воротки. Конечная реакция дает еле заметное зеленое окрашивание. Умножая степень разведения на 0,016, получают количество билирубина в 1 мл сыворотки.

Метод Синева. Стандарт Синева (двухромовокислый калий 0,1, серная кислота 3,0 и дистиллированная вода 200,0), соответствующий по своей окраске слабожелтому оттенку сыворотки лошади, принимается за едини­цу. Исследование производится в штативе. Рядом с пробиркой, содержащей стандарт, помещается пробирка с 0,5 мл испытуемой сыворотки. Затем при помощи градуированной пипетки в испытуемую сыворотку добавляют по 0,5 мл 30%-ного раствора поваренной соли до тех пор, пока окраска не будет соответствовать цвету стандарта. Количество билирубина определяется по формуле: 0,5 +Х=количеству билирубиновых единиц. В нормальной сыворотке цвет соответствует стандарту и не требует разведения, а потому количество билирубина по этой формуле будет равняться 0,5+0,5=1,0.

Количество билирубина в сыворотке крови здоровой лошади (в мг на 100 мл), определенное колориметрическим методом, по данным отдельных авторов, колеблется в следующих пределах.

По Хрусталеву 0,37—3,0, среднее 1,09; по Синеву 0,3 —1,0, среднее 0,8;

по Симонову 0,19—1,09, среднее — 0,64.

Содержание билирубина в сыворотке значительно повышается при инфлю­энце, крупозной и гриппозной пневмонии, мыте и некоторых других заболе­ваниях.

Наиболее высокие цифры отмечаются при кровепятнистой болезни, отравлении S0₂ и хвощом, когда количество билирубина повышается до 4 мг. Максимальные изменения обнаружены при энцефаломиэлите лошадей (8—12 мг на 100 мл сыворотки).

Значительные билирубинемии отмечаются при большом количестве за­болеваний, имеющих совершенно различную клиническую картину, а потому могут быть с успехом использованы в дифференциации процессов и для про­гноза.

Определение количества гемоглобина. Количество гемоглобина можно опре­делить или спектроскопически, посредством определения количества железа, или путем измерения красящей способности крови (колориметрически).

Для клинических целей используется последний метод, который требует небольшого количества крови и дает возможность быстро определить количество гемоглобина. Наиболее распространенным является метод Говерса в видоиз­менении Сали.

Определение гемоглобина по Сали основано на том, что гемоглобин крови в растворе соляной кислоты переходит в солянокислый гематин, который и сравнивается с гематином определенной концентрации, взятом в качестве стан­дарта. Процент гемоглобина в этом случае определяется колориметрически.

Набор Сали состоит из запаянной стандартной пробирки, наполненной раствором солянокислого гематина. Ввиду того, что стандартная жидкость довольно быстро выцветает, в последнее время выпущены стандарты из цвет­ного стекла, окрашенные под цвет солянокислого гематина металлическими окислами. Эти стандарты не выцветают даже под действием прямого солнечного света.

Между стандартными пробирками помещается пробирка, имеющая деления от 10 до 140 или от 10 до 170 такого же диаметра, как и первая. Пробирка

с делением от 10 до 140 предназначена для определения гемоглобина в единицах Сали, а от 10 до 170—в процентах.

Подставка, в которой помещаются стандартные и градуированные про­бирки, представляет собою деревянную колодку с вырезанными продольными отверстиями и углублениями для них. Сзади колодки прикреплено матовое стекло, которое дает рассеянный свет; на его фоне резко оттеняется окраска стандарта и испытуемой сыворотки.

Для взятия крови прилагается капиллярная пипетка с меткой 20 мм, которая определяет количество крови, взятой для исследования.

Кроме гемоглобинометра, для определения гемоглобина необходимо иметь N/10 раствор НС1 и дистиллированную воду.

Техника определения следующая. В градуированную пробирку до метки 20 набирается N/10 раствор НС1, затем в капилляр до метки 20 мм³ насасы­вается кровь и, осторожно очистив конец капилляра, переносят ее в пробирку

Рис. 81. Гемоглобино­метр Сали.

с соляной кислотой. Кровь осторожно выдувают в А710 раствор соляной кислоты, содержимое пробирки из верх­него прозрачного слоя набирается в капилляр и снова выдувается в пробирку.

Капилляр промывается 2 или 3 раза и осторожно удаляется из пробирки. Кровь гемолизируется, и при распаде образуется солянокислый гематин. Жидкость постепенно становится коричневой. Спустя 5—7 минут после выдувания крови, в пробирку начинают при­бавлять дистиллированную воду. Вначале прибавляют по нескольку капель, а затем, по мере изменения цвета и приближения его к стандарту,—то одной капле. Кровь смешивается или стеклянной палочкой с утолщением на конце или же покачиванием прсбирочки. Необходи­мо следить за тем, чтобы жидкость при смешивании не терялась.

Уровень жидкости после разведения указывает на количество гемоглобина. Учет ведется по нижнему ме­ниску жидкости. Допустимой ошибкой при вторичном исследовании той же самой крови считается расхожде­ние в пределах пяти делений. Метка 80 на пробирке с делением до 140 и цифра 100 на пробирке с делением до 170 соответствует 16,0—17,0 гемоглобина в 100 мл кро­ви. Чтобы получить абсолютную цифру, показывающую количество гемоглобина в граммах в 100 мл крови, необходимо показания гемометра в процентах Сали умножить на 0,17, а количество в единицах— на коэффициент 0,2125.

Вид животного	Средний показатель в % Сали	Колебания	В 100 мл крови в г	Фамилия автора
Крупный рогатый скот .... Овцы Козы Буйволы Яки Верблюды Лошади Свиньи Собаки Кошки Кролики Куры Гуси	65 68 63 49 57 90 80 67 80 65 69 75 95	56—74 54—80 45—81 28—70 36—78 66—114 50—110 55—79 65—95 47—83 51—87 51—99 80—110	11,0 11,6 10,7 8,3 9,6 15,2 13,6 10,2 13,6 11,0 11,7 12,7 16,1	Д. Соколов Л. Лебедев B. Чагин К. Мавсун-Заде П. Карасев Н. Семушкин C. Хрусталев С. Смирнов Ф. Михайлов Баранов A. Васильев B. Зайцев C. Веремейчик

Количество гемоглобина у здоровых животных колеблется в следующие пределах (см. табл. на стр. 418).

Колебания гемоглобина зависят от возраста, пола, породы, характера кормления и некоторых других условий. При патологических процессах ко­личество гемоглобина может быть увеличено и уменьшено по сравнению с нор­мальными показателями.

Увеличение количества гемоглобина носит название плейохромии. Она может возникнуть вследствие сгущения крови при потере жидкости организ­мом (понос, рвота, потливость), при образовании экссудатов и транссудатов, Плейохромию отмечают при кровепятнистой болезни лошадей, интоксикациях и отравлениях. Повышение количества гемоглобина отмечается при физическом напряжении лошади. При хорошей подготовке (тренировка) количество гемо­глобина остается почти без изменений.

Уменьшение гемоглобина (олигохромемия) встречается довольно часто и особенно при заболеваниях, связанных с анемией. Олигохромемия является симптомом острых и хронических заболеваний, различных по своему проис­хождению.

Олигохромемия связана с уменьшением общего количества эритроцитов или обеднением эритроцитов гемоглобином. Следовательно, олигохромемия определяет не только степень, но и характер анемии. Необходимо, однако, учесть, что правильная оценка может быть сделана только при условии подсче­та эритроцитов и определения величины цветного показателя.

Определение цветного показателя. Цветной показатель дает представление об отношении гемоглобина к красным кровяным тельцам. Метод определения цветного показателя основан на сравнении. Если в норме цветной показатель равен примерно единице, то изменение этой цифры в сторону увеличения или уменьшения рассматривается, как весьма важный показатель нарушения соотношения между эритроцитами и гемоглобином.

У животных определение цветного показателя проводится по формуле:

гемоглобин 2 эритроциты 2 гемоглобин 2 х эритроциты 1

гемоглобин 1 / эритроциты 1 = гемоглобин 1 x эритроциты 2

где гемоглобин 1 и эритроциты 1 показывают среднее количество гемоглобина и эритроцитов у здорового животного и гемоглобин 2 и эритроциты 2—найден­ное количество гемоглобина и эритроцитов у исследуемых животных. Если у лошади взять за норму количество гемоглобина 75, а эритроцитов 7 500 000, то цветной показатель будет равен единице. Всякое отклонение в количестве гемоглобина и эритроцитов поведет к изменению цветного показателя. Необ­ходимо учитывать только такие отклонения от нормы, которые превышают 15%. Небольшие отклонения учитывать не следует.

Определение цветного показателя имеет значение в дифференциации ане­мий. При постгеморрагических анемиях, когда имеется одновременно умень­шение как количества эритроцитов, так и гемоглобина, цветной показатель приближается к единице; ниже единицы цветной показатель бывает при вто­ричных анемиях, при которых снижается количество гемоглобина, при почти нормальном или слегка сниженном количестве эритроцитов; выше единицы цветной показатель отмечается при гемолитических анемиях, когда в ток крови выбрасывается значительное количество молодых клеток (повышенная регене­рация).

Для суждения о средней насыщенности эритроцитов гемоглобином прак­тически можно использовать определение кровяного числа. Оно получается делением найденного количества гемоглобина на число эритроцитов в миллио­нах, например:

75% / 7(000000) = 11 или 90% / 10(000000) =9

Величина кровяного числа неодинакова у различных животных и зависит от количества эритроцитов и гемоглобина в норме, но в среднем она прибли­жается к 10.