9.5.3. Характерные особенности денатурации
Процесс денатурации, охватывает сразу много аминокислотных остатков, и поэтому является кооперативным процессом.
Денатурация небольших глобулярных белков относится к переходам типа «все или ничего», то есть переходам первого рода. Это означает, что во время перехода наблюдаются, главным образом, нативное и/или денатурированное состояния белка, а «полуденатурированных», полусвернутых молекул практически не встречается. Молекулы могут находиться в полуденатурированном или полусвернутом состояниях, только в переходном, промежуточном состоянии, однако вероятность нахождения молекул в таком состоянии крайне мала.
Рис. 9–9.
Температурная зависимость удельной
изобарической теплоемкости лизоцима
при рН=4,5. Положение и ширина пика
теплоемкости определяют, соответственно,
температуру
и температурный интервал
(см. рис.3–96 б,
с. 493) перехода первого рода
Калориметрические измерения теплоемкости
подтверждают тот факт, что тепловая
денатурация глобулярных белков происходит
путем фазовых переходов первого рода,
во время которых теплоемкость достигает
экстремальных значений (рис. 9–9).
Площадь под пиком теплоемкости равна
поглощенному при плавлении теплу
(порядка
аминокислотных остатков). Теплоемкость
денатурированного белка выше теплоемкости
его в нативном состоянии за счет роста
числа степеней свободы при частичном
или полном разворачивании белка.
На рис. 9–10 представлена фазовая диаграмма конформационных состояний лизоцима при рН=1,7 в зависимости от концентрации денатуранта (гуанидингидрохлорида) и температуры. В рассматриваемой области концентраций и температур наблюдаются три состояния: нативное, температурно-денатурированное (более компактное, чем клубок, но обладающее подвижными боковыми группами, так же как в клубке) и клубковое. Сплошная линия показывает середину перехода между состояниями. Область перехода, в которой соотношение фаз изменяется от ~(1:9) до ~(9:1), находится между соответствующими пунктирными линиями.
|
Рис. 9–11. Зависимость избыточной (по сравнению с теплоемкостью чистого растворителя) изобарической теплоемкости раствора белка от температуры для апомиоглобина (миоглобина, лишенного гема) при повышении и понижении температуры (стрелки на кривых). При повышении температуры сначала наблюдается ренатурация (восстановление нативной структуры), а затем тепловая денатурация. При понижении температуры происходит обратимая «холодовая» денатурация |
Экспериментально у ряда белков наблюдается и, так называемая, «холодовая» денатурация, возникающая при понижении температуры в области ~10°C и ниже (рис. 9–11). При этих температурах свободная энергия белка (плюс энергия водной среды) в нативном состоянии оказывается выше, чем в денатурированном. Это связано с тем, что с понижением температуры, во-первых, отрицательная энергия гидрофобных взаимодействий, удерживающая глобулу в компактном состоянии, уменьшается по величине. Этот эффект в макроскопических системах подобен уменьшению внешнего давления, что приводит к уменьшению температуры фазового перехода, например, жидкость – газ. Во-вторых, с понижением температуры уменьшается энтропия. Оба эффекта приводят к росту свободной энергии нативного состояния и уменьшению разности свободных энергий в нативном и денатурированном состоянии при понижении температуры. Поскольку с ростом температуры выше комнатной (при тепловой денатурации) свободная энергия так же растет, то в результате стабильность белка, определяемая как разность свободных энергий в нативном и денатурированном состоянии, имеет максимум вблизи комнатных температур.
При денатурации белок как бы плавится, его объем увеличивается. Следует заметить, что при «холодовой» денатурации объем растет значительно сильнее, чем при тепловой денатурации, так как в первом случае белковая цепь практически полностью разворачивается.