§9.5.4. Расплавленная глобула

Денатурация и переход нативного белка в неупорядоченный клубок может происходить по-разному у разных белков и даже у одних и тех же белков, но при различных воздействиях. Некоторые (особенно небольшие) нативные белки разворачиваются прямо в клубок. Для очень многих белков в процессе разворачивания нативного белка в клубок наблюдается промежуточное состояние – интермедиат расплавленной глобулы. Например, денатурация лизоцима, фазовая диаграмма которого представлена на рис. 9–11, гуанидингидрохлоридом приводит прямо к образованию клубка. При сворачивании лизоцима в почти чистой воде (при сильном разбавлении водой крепкого раствора гуанидингидрохлорида, где находились клубкообразные белковые цепи лизоцима) появляется компактный метастабильный интермедиат сворачивания типа расплавленной глобулы.

При образовании расплавленной глобулы исчезает упорядоченность боковых групп и фиксированность глобулярной структуры, что приводит к потере активности белка. Схематически, в упрощенном виде, переход из нативного состояния к состоянию расплавленной глобулы показан на рис. 9–12.

Расплавленная глобула в основном сохраняет компактность, ядро (с небольшим набуханием), развитую вторичную структуру, но теряется уникальная компактная упаковка боковых групп, которые приобретают определенную подвижность. Это означает, что в расплавленном состоянии белок обладает большей энергией, благодаря ослаблению внутримолекулярных взаимодействий, но, в то же время, и большей энтропией, благодаря усилению подвижности боковых групп. В результате расплавленное состояние может стать стабильным (иметь минимум свободной энергии).

Рис. 9–12. Схематические модели нативной (а) и расплавленной (б) глобулы молекулы белка, состоящей, для простоты изображения, только из двух α-спиралей (светлые цилиндры), соединенных петлей. Боковые группы гидрофобного ядра белка (заштрихованные фигуры) в нативном состоянии плотно уложены, а в расплавленном – приобретают свободу движений. В поры, возникающие в ядре белка в расплавленном состоянии, проникают молекулы воды

Переход нативная – расплавленная глобула происходит по типу фазовых переходов первого рода, таких как плавление однородных периодических кристаллов, в то время как белок – это гетерогенная неоднородная система, лишенная периодичности. В отличие от обычных полимерных глобул, которые разрушаются путем постепенного разбухания, белковая глобула при переходе в состояние расплавленной глобулы преодолевает энергетический барьер.

9.5.5. Механизм денатурации

При денатурации (рис. 9–13) в начале расширения (уменьшения плотности ρ) глобулы жесткие сегменты перемещаются как целое со всем семейством боковых групп. Поэтому при расширении создается примерно одинаковый свободный объем вблизи каждой боковой группы. Энергия глобулы при расширении возрастает в результате разрыва водородных связей и других нековалентных взаимодействий. Энтропия в начале расширения еще существенно не меняется из-за малости свободного объема, то есть свободная энергия при малом расширении растет. Появление свободы конформационных перемещений (поворотной изомеризации) у боковых групп и возможности проникновения молекул растворителя в глобулу происходит для всех групп одновременно, когда расширение глобулы достигает некоторого предела (барьера “t”). Белок «плавится» весь сразу, как микроскопическое твердое тело. После плавления более быстрое возрастание TS по сравнению с возрастанием U приводит к тому, что свободная энергия уменьшается. При дальнейшем уменьшении плотности соотношение скоростей изменяется на обратное. В результате F начинает возрастать, и на кривой F(S) появляется минимум. Между состояниями нативной глобулы N и расплавленной глобулы D возникает потенциальный барьер. Структура расплавленной глобулы после преодоления барьера становится стабильной, как и структура глобулы в нативном состоянии.

Рис. 9–13. Зависимости энергии E, энтропии S, свободной энергии F от плотности глобулы ρ, принятой за 1 в нативном N состоянии. D – состояние расплавленной глобулы	Рис. 9–14. Характерная зависимость относительной плотности ρ (ρ=1 для глобулярного состояния) полимера от энергии ε взаимодействия мономеров, выраженной в единицах kBT. Излом на кривой в точке, обозначенной пунктиром, характерен для фазовых переходов второго рода

Итак, денатурированный белок, в зависимости от силы растворителя и гидрофобности цепи, может быть как рыхлым (типа неупорядоченного клубка), так и расплавленной глобулой, насыщенной водой, «мокрой» (рис. 9–12). Примером перехода глобула – клубок первого типа может быть холодовая денатурация (рис. 9–11). Тепловая денатурация чаще идет через состояние расплавленной глобулы.

Набухание и разворачивание расплавленной глобулы в клубок также является кооперативным переходом, но, скорее всего, не фазовым переходом первого рода. Такие переходы происходят плавно (постепенно, без преодоления порогов) и хорошо описываются в рамках теории (см. с. 323-324) переходов глобула – клубок для полимеров (см. рис. 9–14).

Возвращаясь к фазовой диаграмме лизоцима (см. рис.9-10), можно сказать, что узкие области перехода (нативное состояние ↔ клубок и нативное ↔ температурно-денатурированное состояние) соответствуют фазовым переходам первого рода, а широкий переход (температурно-денатурированное состояние ↔ клубок) может происходить для одних белков плавно (не фазовым переходом I-го рода), а для других – фазовым переходом первого рода.