Метод электрофореза для определения массы полимерных молекул
Для определения молекулярной массы молекул используется метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Анализируемая смесь, например, смесь белковых молекул обрабатывается додецилсульфатом натрия [ДСН (SDS)], под действием которого белки денатурируют, превращаясь в развернутые полипептидные цепи. Кроме того, связываясь с ДСН, полипептидные цепи приобретают отрицательный заряд.
В камере для электрофореза, заполненной полиакриламидным гелем, между катодом и анодом создается электрическое поле. Полипептидные заряженные цепи, помещаемые вблизи катода, под действием электрического поля, по пористым каналам в геле, движутся к аноду по вертикальной «дорожке». Скорость движения линейных макромолекул (следовательно, и длина пробега за определенное время) зависит, главным образом, только от их молекулярной массы. После окончания электрофореза зоны белков в полиакриламидном геле выявляются с помощью красителя. Затем по положению цветных полосок в дорожке определяются их молекулярные массы. На рис. 3–89 приведены электрофореграммы гомогенного белка (дорожка (а)) и смеси белков (дорожка (б)).
Рис. 3–89. Определение молекулярной массы макромолекул с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (поснения в тексте)
Степень генетического родства определяется, главным образом, по полиморфным локусам, представляющим собой нейтральные мутации, не проявляющиеся фенотипически и не влияющие на жизнеспособность и репродуктивные свойства особей. Такие локусы-маркеры расположены в некодирующих областях генома человека. Они представляют собой тандемные повторы – последовательности, состоящие из различного количества мономеров. Мономеры в свою очередь могут содержать от одного до нескольких десятков нуклеотидов, образуя мини- и микросателлитные маркеры.
Тандемные повторы относительно равномерно распределены на хромосомах, более подвержены изменчивости, чем кодирующие участки генома. На хромосомах разного происхождения (мать/отец) эти участки содержат, как правило, разное количество мономеров, то есть отличаются по длине. Информативность таких многоаллельных маркеров значительно выше, чем точковых замен, поскольку наследование их подчиняется менделеевским закономерностям (п.3.7.5). Если, например, использовать 5 полиморфных локусов-маркеров, каждый из которых может находиться в 5 аллельных состояниях, то число возможных вариантов сочетаний составит 55=3125 в данной хромосоме. Установлено, что у людей, находящихся в родственных отношениях, аллельные состояния генов практически совпадают, причем, чем ближе родство, тем выше вероятность совпадения. У посторонних людей, в рассмотренном примере, вероятность совпадения ничтожно мала ~1/3125.
Характер расположение полос минисателлитных ДНК на электрофореграмме (ДНК-отпечаток) индивидуален практически так же как и отпечатки пальцев. Поэтому метод идентификации по тандемным повторам называется геномной дактилоскопией (genetics fingerprinting).
В настоящее время наиболее эффективным (достоверным, достаточно быстрым и не требующим большого количества биологического материала) методом идентификации личности считается сравнительный анализ электрофореграмм фрагментов ДНК, полученных в результате ПЦР и представляющих собой тримерные и тетрамерные короткие тандемные повторы (STR – short tandem repearts).
На рис. 3–90 представлен пример диагностики отцовства данным методом. Дорожка М соответствует электрофореграмме мужчины, Ж – женщины и Р – ребенка. Поскольку у каждого человека только два гомологичных локуса, то в геноме присутствует только два аллеля по этому локусу. В результате на электрофореграмме в каждой дорожке (М, Ж, Р) имеется отпечаток двух разных по длине фрагментов, содержащих различное количество повторяющихся мономеров для гетерозиготного состояния локуса, и один отпечаток – в случае гомозиготного состояния локуса.
Сравнение аллелей для любой пары индивидов позволяет или опровергнуть, или установить возможность их генетического родства. У родного ребенка размер одного фрагмента (число повторов мономеров) совпадает с одним из фрагментов матери, а размер второго фрагмента совпадает с размером одного из фрагментов отца. В случае отсутствия у ребенка и мужчины одинаковых аллелей локуса (совпадений длин фрагментов) их родство (родитель - ребенок) исключено. Дальнее родство выявить значительно сложнее. Однако с ростом числа идентифицируемых STR-маркеров вероятность установления родства увеличивается (в).
Рис. 3–90. Схематическая иллюстрация установление биологического родства путем анализа минисателлитных STR-маркеров
Аналогичные методики используются для ДНК-диагностики заболеваний в медицине, в криминалистической экспертизе, в сельском хозяйстве и биотехнологической промышленности.
Анализом STR-маркеров в совокупности с другими методами была проведена экспертиза останков девяти человек, найденных в 1991 г. в окрестностях Екатеринбурга со следами насильственной смерти, с целью определения принадлежности их царской семье императора Николая II, расстрелянной в 1918 г. Было установлено, что среди убитых было четыре мужчины и пять женщин. Именно столько женщин было в царской семье в Екатеринбурге. Было установлено, что среди девяти останков находились отец, мать и трое дочерей.
Заметим, что методом молекулярно-генетического анализа нельзя выявить мужа и жену, так как между ними нет родственной генетической связи. Но это можно сделать, если в анализируемой группе есть их дети. Далее было проведено сравнение генетического материала, полученного из останков, с ДНК, выделенной из крови ныне живущих родственников Николая II. На основании полученных данных было с высокой степенью достоверности установлено, что останки, обнаруженные в Екатеринбургском захоронении, действительно принадлежат императору Николаю II и его семье.