3.7.9. Метод молекулярно–генетической идентификации
Геном человека содержит от 50 до 100 тысяч генов. Гомологичные гены, находящиеся в гомологичных хромосомах в одних и тех же локусах, могут находиться в разных аллельных состояниях. Аллельные гены отличаются небольшими изменениями последовательности нуклеотидов. Уникальное сочетание аллельных состояний всех пар генов определяет биологическую индивидуальность каждого человека. Секвенирование полноразмерной ДНК (всех экзонов) – определение нуклеотидной последовательности у каждого человека, то есть «ДНК-паспортизация» людей теоретически возможна, но является дорогой, требующей больших затрат времени процедурой. На практике, как правило, используются другие методы генетической идентификации.
Различия ДНК на молекулярном уровне, определяющие индивидуальность каждого человека, составляют (0,2–0,3)%, а на (99,8–99,7)% последовательности ДНК идентичны. Эти (0,2–0,3)% ДНК представляют собой вариабельные участки ДНК. Наличие вариабельных участков ДНК позволяет говорить о полиморфизме генома. Полиморфизм генома лежит в основе методов идентификации фрагментов ДНК, установления генетического родства. При этом используют локусы, имеющие несколько аллельных состояний. Такие локусы называются полиморфными маркерами.
Определение половой принадлежности давно умершего человека производится по ничтожному весовому количеству молекулы ДНК, выделенной из костных останков. Половые хромосомы X и Y несут гомологичный ген, кодирующий компонент зубной эмали амелогенин. Этот ген в хромосомах Х и Y находится в разных аллельных состояниях: ген в Y–хромосоме на 6 нуклеотидов длиннее, чем в Х-хромосоме. У мужчин содержится пара хромосом ХY, у женщин – пара ХХ хромосом. Для определения половой принадлежности достаточно сравнить длины амелогениновых генов в локусах гомологичных половых хромосом. Такое различие генотипов характерно для большинства животных, в том числе и для человека. Для того чтобы выявить содержится ли в данном образце ДНК Y хромосома (то есть образец принадлежит мужчине) нужно выделить 1/30 000 000 часть всего генома человека.
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Из одной исходной молекулы ДНК получить данный фрагмент в нужных для анализа количествах позволяет метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). За открытие схемы полимеразной цепной реакции Кэри Мюллису была присуждена Нобелевская премия. Метод ПЦР лежит в основе ДНК-идентификации личности, установления родства людей, выявления генов наследственных болезней и др. Он позволяет многократно воспроизводить (амплифицировать) выбранный фрагмент ДНК. Схема метода представлена на рис. 3–88.
На первой стадии двунитевая ДНК нагревается до 90°С для разрушения водородных связей, соединяющих комплементарные нити, разделения цепей и получения однонитевых ДНК. Затем смесь охлаждается в присутствии достаточного количества дезоксирибонуклеозидтрифосфатов [(дНТФ), см. п.8.1.2], термостабильной ДНК-полимеразы и двух коротких (12–20 нуклеотидов) фрагментов ДНК, называемых праймерами (см. гл. VIII). Один из праймеров комплементарен участку нити ДНК слева от изучаемого локуса, а второй комплементарен участку другой нити справа от локуса. Праймеры связываются (гибридизуются) с соответствующими участками ДНК и служат началом синтеза новой комплементарной нити на матрице ДНК. Этот цикл повторяется с той же самой реакционной смесью 20–30 раз. При проведении ПЦР двунитевые фрагменты ДНК, равные расстоянию между праймерами, начинают накапливаться после третьего цикла. За 30 циклов количество синтезированных фрагментов составляет около миллиарда.
Рис. 3–88. Схема полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющая выделять и воспроизводить (амплифицировать) выбранный фрагмент ДНК (с серой заливкой)