2. Визуализация результатов пцр методом электрофореза нуклеиновых кислот в 1,5% агарозном геле (Maniatis, 1982)

Готовили 1,5%-ный агарозный гель с лунками для внесения проб. Для этого 1,5 г агарозы разводили в 100 мл рабочего трис-ацетатного буферного раствора (24,2 г трис-(гидрокси)аминометана, 5,7 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл 0,5 М раствора этилендиаминотетрауксусной кислоты, pH 8.0) и добавляли 10мкл 10%-ного водного раствора бромида этидия. Суспензию нагревали на водяной бане до полного растворения агарозы, периодически помешивая. Раствору давали остыть примерно до 50˚С и заливали в форму для агарозного блока, вставляли гребенку для образования лунок и давали агарозе застыть до состояния геля.

Из-под слоя масла отбирали 10 мкл раствора амплифицированной ДНК и смешивали с 10 мкл буферного раствора для нанесения проб (50% глицерина, 0,25% бромфенолового синего в дистиллированной воде). Полученную смесь переносили в лунки геля. Камеру для электрофореза «Helicon» (г. Москва) подключали к источнику питания «Эльф-2» (Россия), соблюдая полярность. Проводили электрофорез в течение 15 минут при напряжении 200 вольт (краситель должен пройти не менее 2 см геля). Отключали ток. Помещали гель в окно трансиллюминатора «Biokom UVT-1» (Франция). Результат регистрировали с использованием системы видеодокументирования «VITRan».

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ Statistica v. 8.0. Данные представляли в виде относительных и абсолютных частот. Анализ различий частот признаков в группах проводили с использованием критерия % и двустороннего теста точного критерия Фишера. Различия считали статистически значимыми при р<0.05.

3.Результаты и их обсуждение

По данным литературы известны ассоциации частот генотипов ОНП Fas-670A/G ОНП Fas-1377A/G в промоторной части гена Fas с различными заболеваниями. Среди населения, проживающего на территории Российской Федерации, не проводилось исследований по выявлению частот генотипов ОНП Fas-670A/G ОНП Fas-1377A/G в промоторной области гена Fas, что определяет практическую значимость данного исследования.

Анализ аллельных вариаций в составе ОНП Fas -670A/G, Fas -1377G/A проводился методом аллель-специфической ПЦР с помощью олигонуклеотидных праймеров.

Продукты реакции детектировали с помощью электрофореза в 1.5 % агарозном геле, содержащем флуоресцентный краситель бромид этидия.

На первом этапе настоящего исследования проводилось генотипирование образцов периферической крови здоровых доноров, больных раком толстого кишечника и герпесвирусной инфекцией по ОНП Fas-670A/G.

Результаты исследований генотипов ОНП Fas-670A/G представлены в таблице 5.

Таблица 5

Частота генотипов однонуклеотидного полиморфизма Fas-670A/G в клетках периферической крови больных раком толстого кишечника, герпесвирусной инфекцией и здоровых доноров

Тип образцов	Генотипы гена Fas	Частота генотипов ОНП Fas-670A/G
Здоровые доноры n = 51	гомозигота AА	3,9%
	гомозигота GG	35,3%
	гетерозигота AG	60,8%
Рак толстого кишечника n = 44	гомозигота AА	0%
	гомозигота GG	0%*
	гетерозигота AG	100%*
Герпесвирусная инфекция n = 35	гомозигота AА	8,6%
	гомозигота GG	14,3%*
	гетерозигота AG	77,1%

* - статистически значимые различия по сравнению со здоровыми донорами (р<0,05)

У здоровых доноров частота генотипа FAS-670AA составляла 3,9%, генотипа FAS-670AG –60,8%, генотипа FAS-670GG –35,3%.

Генотип FAS-670AG встречался у всех 44 больных раком толстого кишечника (100%). У больных герпесвирусной инфекцией частота генотипа FAS-670AA составляла 8,6%, генотипа FAS-670AG – 77,1%, генотипа FAS-670GG – 14,3%.

Исследовали частоты генотипов Fas-670A/G в клетках периферической крови больных раком толстого кишечника, герпесвирусной инфекцией и здоровых доноров. Было показано, что у больных раком толстого кишечника частота генотипа -670AG статистически значимо (в 1,65 раза) была выше по сравнению со здоровыми донорами (р<0,001). При этом у больных герпесвирусной инфекцией частота генотипа -670GG была в 2,5 раза ниже (p=0,034) (рис.3).

Рис.3. Частота генотипов Fas-670A/G в клетках периферической крови больных раком толстого кишечника и герпесвирусной инфекцией.

* - статистически значимые различия (р<0,05) по сравнению со здоровыми донорами

Исследовали также частоты генотипов ОНП Fas-670A/G у мужчин и женщин, больных раком толстого кишечника, герпесвирусной инфекцией и у здоровых доноров. Результаты исследований представлены в таблице 6.

Таблица 6

Частота генотипов однонуклеотидного полиморфизма Fas-670A/G в клетках периферической крови мужчин и женщин, больных раком толстого кишечника, герпесвирусной инфекцией и здоровых доноров

Пол	Тип образцов	Генотипы гена Fas	Частота генотипов Fas-670A/G
Мужчины	Здоровые доноры n = 9	гомозигота AА	0%
		гомозигота GG	11,1%
		гетерозигота AG	88,9%
	Рак толстого кишечника n = 18	гомозигота AА	0%
		гомозигота GG	0%
		гетерозигота AG	100%
	Герпесвирусная инфекция n = 21	гомозигота AА	5%
		гомозигота GG	14,3%
		гетерозигота AG	80,7%
Женщины	Здоровые доноры n = 42	гомозигота AА	4,8%
		гомозигота GG	40,5%
		гетерозигота AG	54,8%
	Рак толстого кишечника n = 26	гомозигота AА	0%
		гомозигота GG	0%*
		гетерозигота AG	100%*
	Герпесвирусная инфекция n = 14	гомозигота AА	14,3%
		гомозигота GG	14,3%
		гетерозигота AG	71,4%

* - статистически значимые различия по сравнению со здоровыми донорами (р<0,05)

При сравнении фрагмента генома мужчин, больных раком толстого кишечника и герпесвирусной инфекцией, со здоровыми не выявлены статистически значимые различия по частотам как гомозигот AА и GG, так и гетерозигот AG по ОНП Fas-670A/G (рис.4).

Рис.4. Частота генотипов Fas-670A/G в клетках периферической крови мужчин, больных раком толстого кишечника и герпесвирусной инфекцией.

По сравнению со здоровыми донорами у женщин, больных раком толстого кишечника, частота генотипа -670AG статистически значимо (в 1,83 раза) была выше (р<0.001). При этом генотипы -670АА и -670GG в образцах крови онкологических больных не выявлялись (рис.5).

Рис.5. Частота генотипов Fas-670A/G в клетках периферической крови женщин, больных раком толстого кишечника и герпесвирусной инфекцией.

* - статистически значимые различия (р<0,05) по сравнению со здоровыми женщинами

При сравнении мужчин и женщин, больных раком толстого кишечника, а также мужчин и женщин, больных герпесвирусной инфекцией, и здоровых мужчин и женщин не было обнаружено статистически значимых различий по частотам как гомозигот AА и GG, так и гетерозигот AG по ОНП Fas-670A/G.

На следующем этапе настоящего исследования проводилось генотипирование образцов периферической крови здоровых доноров, больных раком толстого кишечника и герпесвирусной инфекцией ОНП Fas-1377AG. Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7

Частота генотипов однонуклеотидного полиморфизма Fas-1377A/G в клетках периферической крови больных раком толстого кишечника, герпесвирусной инфекцией и здоровых доноров

Тип образцов	Генотипы гена Fas	Частота генотипов ОНП Fas-1377A/G
Здоровые доноры n = 46	гомозигота AА	2,2%
	гомозигота GG	30,4%
	гетерозигота AG	67,4%
Рак толстого кишечника n = 36	гомозигота AА	22,2%
	гомозигота GG	36,1%
	гетерозигота AG	41,7%*
Герпесвирусная инфекция n = 29	гомозигота AА	13,8%
	гомозигота GG	65,5%*
	гетерозигота AG	20,7%*

* - статистически значимые различия по сравнению со здоровыми донорами (р<0,05)

У здоровых доноров частота генотипа FAS-1377AA составляла 2,2%, генотипа FAS-1377AG –67,4%, генотипа FAS-1377GG –30,4%.

Генотип FAS-1377AA встречался у 22,2% больных раком толстого кишечника, генотип FAS-1377AG – у 41,7%, генотип FAS-1377GG – у 36,1%. У больных герпесвирусной инфекцией частота генотипа FAS-1377AA составляла 13,8%, генотипа FAS-1377AG – 20,7%, генотипа FAS-1377GG – 65,5%. Было выявлено, что при сравнении со здоровыми донорами у больных раком толстого кишечника частота генотипа Fas-1377AG статистически значимо была ниже в 1,62 раза (р=0,03). В отношении других генотипов статистически значимых различий обнаружено не было; по сравнению со здоровыми донорами у больных герпесвирусной инфекцией частота генотипа Fas-1377GG статистически значимо (в 2,2 раза) была выше (p=0,004). Наряду с этим генотип -1377АG детектировался реже в 3,26 раза, чем у здоровых доноров (р=0,002) (рис.6).

Рис.6. Частота генотипов Fas-1377A/G в клетках периферической крови больных раком толстого кишечника и герпесвирусной инфекцией.

* - статистически значимые различия (р<0,05) по сравнению со здоровыми донорами

Исследовали также частоты генотипов ОНП Fas-1377A/G у мужчин и женщин, больных раком толстого кишечника и герпесвирусной инфекцией, и у здоровых доноров. Результаты исследований представлены в таблице 8.

Таблица 8

Частота генотипов однонуклеотидного полиморфизма Fas-1377A/G в клетках периферической крови мужчин и женщин, больных раком толстого кишечника, герпесвирусной инфекцией, и здоровых доноров

Пол	Тип образцов	Генотипы гена Fas	Частота генотипов Fas-1377A/G
Мужчины	Здоровые доноры n = 9	гомозигота AА	0%
		гомозигота GG	22,2%
		гетерозигота AG	77,8%
	Рак толстого кишечника n = 18	гомозигота AА	27,8%
		гомозигота GG	27,8%
		гетерозигота AG	44,4%
	Герпесвирусная инфекция n = 19	гомозигота AА	15,8%
		гомозигота GG	57,9%
		гетерозигота AG	26,3%*
Женщины	Здоровые доноры n = 37	гомозигота AА	2,7%
		гомозигота GG	32,4%
		гетерозигота AG	64,9%
	Рак толстого кишечника n = 18	гомозигота AА	16,7%
		гомозигота GG	44,4%
		гетерозигота AG	38,9%*
	Герпесвирусная инфекция n = 10	гомозигота AА	10%
		гомозигота GG	80%*
		гетерозигота AG	10%*

* - статистически значимые различия по сравнению со здоровыми донорами (р<0,05)

По сравнению со здоровыми донорами у мужчин, больных герпесвирусной инфекцией, частота генотипа -1377АG детектировалась на реже в 2,96 раза (р = 0,016) (рис.7).

Рис.7. Частота генотипов Fas-1377A/G в клетках периферической крови мужчин, больных раком толстого кишечника и герпесвирусной инфекцией.

* - статистически значимые различия (р<0,05) по сравнению со здоровыми мужчинами

По сравнению со здоровыми донорами у женщин, больных раком толстого кишечника, частота генотипа Fas-1377AG статистически значимо (в 1,67 раза) была ниже (р=0,03). В отношении других генотипов статистически значимых различий обнаружено не было.

При сравнении со здоровыми донорами у женщин, больных герпесвирусной инфекцией, частота генотипа Fas-1377GG статистически значимо (в 2,5 раза) была выше (p=0,01). Наряду с этим генотип -1377АG детектировался в 6,5 раз реже, чем у здоровых доноров (р=0,004) (рис.8).

Рис.8. Частота генотипов Fas-1377A/G в клетках периферической крови женщин, больных раком толстого кишечника и герпесвирусной инфекцией.

* - статистически значимые различия (р<0,05) по сравнению со здоровыми женщинами

При сравнении мужчин и женщин, больных раком толстого кишечника, герпесвирусной инфекцией и здоровых мужчин и женщин не было обнаружено статистически значимых различий по частотам как гомозигот AА и GG, так и гетерозигот AG по ОНП Fas-1377A/G.

Полученные результаты показали, что некоторые частоты генотипов однонуклеотидных полиморфизмов -670A/G и -1377G/A у больных раком толстого кишечника и герпесвирусной инфекцией отличаются от соответствующих значений частот генотипов здоровых доноров, что может свидетельствовать о влиянии наличия соответствующих аллельных вариантов генотипов на предрасположенность к данным заболеваниям. Кроме этого, были выявлены статистически значимые различия частот некоторых исследованных генотипов у мужчин и женщин с данными патологиями, что позволяет предположить о том, что наличие исследованных генотипов по-разному влияет на предрасположенность к данным заболеваниям у мужчин и женщин.

У пациентов с герпесвирусной инфекцией частоты генотипов Fas -670A/G не отличались от частот соответствующих генотипов здоровых доноров. В то же время у всех больных раком толстого кишечника был выявлен только генотип FAS-670AG, что в 1,65 раза выше по сравнению со здоровыми донорами. Частоты генотипов FAS-670AG, выявленные в нашем исследовании, отличались от частот соответствующих генотипов, представленных в литературе (Hofflman et al., 2009), где частоты генотипов были более равномерными между собой (FAS -670AA 24,2%, FAS -670AG – 46,3%, FAS -670GG – 29,5%), что, с одной стороны, отражает особенности частот генотипов в разных популяциях, а, с другой стороны, может являться особенностью данной патологии.

Не было выявлено различий между частотами генотипов FAS-670AG у мужчин и женщин с раком толстого кишечника. Тем не менее, было показано, что по сравнению со здоровыми донорами, у женщин, больных раком толстого кишечника, частота генотипа FAS-670AG выше в 1,83 раза при этом у мужчин таких особенностей выявлено не было. Данные говорят о различном влиянии наличия генотипов FAS-670AG у мужчин и женщин на предрасположенность к данной патологии.

У больных раком толстого кишечника частоты генотипов FAS-1377A/G не отличались от здоровых доноров. У больных герпесвирусной инфекцией частота генотипа Fas-1377 GG была в 2,2 раза выше по сравнению со здоровыми донорами, при этом у мужчин частота генотипа -1377АG была в 2,96 раза ниже по сравнению со здоровыми донорами, а у женщин, больных герпесвирусной инфекцией, частота генотипа Fas-1377GG в 2,5 раза выше, чем у здоровых доноров. Таким образом, в отличие от рака толстого кишечника, частота генотипов FAS-1377A/G у больных герпесвирусной инфекцией различна как по сравнению со здоровыми донорами, так и у мужчин и женщин по сравнению друг с другом.

Выводы

1. Выявлено, что у здоровых доноров частота генотипа FAS-670AA составляла 3,9%, генотипа FAS-670AG –60,8%, генотипа FAS-670GG –35,3%; частота генотипа FAS-1377AA составляла 2,2%, генотипа FAS-1377AG –67,4%, генотипа FAS-1377GG –30,4%.

2. Установлено, что генотип FAS-670AG встречался у всех 44 больных раком толстого кишечника (100%). Генотип FAS-1377AA встречался у 22,2% больных раком толстого кишечника, генотип FAS-1377AG – у 41,7%, генотип FAS-1377GG – у 36,1%. По сравнению со здоровыми донорами у больных раком толстого кишечника частота генотипа -670AG статистически значимо в 1,65 раза была выше.

3. Показано, что у больных герпесвирусной инфекцией частота генотипа FAS-670AA составляла 8,6%, генотипа FAS-670AG – 77,1%, генотипа FAS-670GG – 14,3%.; частота генотипа FAS-1377AA составляла 13,8%, генотипа FAS-1377AG – 20,7%, генотипа FAS-1377GG – 65,5%. При сравнении со здоровыми донорами у больных герпесвирусной инфекцией частота генотипа Fas-1377GG статистически значимо в 2,2 раза была выше.

4. При сравнении фрагмента генома мужчин, больных раком толстого кишечника и герпесвирусной инфекцией, со здоровыми не выявлены статистически значимые различия по частотам как гомозигот AА и GG, так и гетерозигот AG по ОНП Fas-670A/G. У мужчин, больных герпесвирусной инфекцией, частота генотипа -1377АG детектировалась реже в 2,96 раза в сравнении со здоровыми донорами.

5. По сравнению со здоровыми донорами у женщин, больных раком толстого кишечника, частота генотипа -670AG статистически значимо в 1,83 раза была выше. У женщин, больных герпесвирусной инфекцией, частота генотипа Fas-1377GG статистически значимо в 2,5 раза выше, чем у здоровых доноров.