2.3 Експерементальна частина
2.3.1 Амфотерні властивості α–аланіну.
Аланін у водному розчині існує у формі біполярного йона і виявляє кислотні і основні властивості:
У дві пробірки вносять по 0,5 мл краплин розчину α –аланіну. В одну з них додають, струшуючи, по краплинам 0,01 моль/л розчин хлоридної кислоти, підфарбований індикатором конго в синій колір (кисле середовище) до появи рожево-червоного кольору (лужне середовище). В іншу пробірку, постійно струшуючи, додають по краплинам 0,01 моль/л розчин гідроксиду натрію, підфарбований фенолфталеїном у рожевий колір (лужне середовище) до зникнення забарвлення (кисле середовище).
2.3.1 Виділення вільних амінокислот із біологічного матеріалу.
У ступку вміщують 2 г розмолотого сухого біологічного матеріалу та заливають 10 мл 75%-вого розчину етилового спирту, нагрітого до 60-700С на водяній бані. Отриману суміш розтирають протягом 15 хвилин і фільтрують через вставлений у лійку складчастий паперовий фільтр в чашку для випарювання, використовуючи її як приймач. Чашку ставлять на киплячу водяну баню та повністю випарюють спирт. Отриманий сухий залишок розчиняють в 1 мл 1 % розчину соляної кислоти та перемішують скляною паличкою протягом 10-15 хвилин.
Для виявлення амінокислот у витяжці до 5 краплин суміші додають 2 мл дистильованої води і 3- 4 краплини розчину нінгідрину. Суміш перемішують і нагрівають на водяній бані при 700С протягом 5 хвилин. Поява синьо-фіолетового забарвлення, засвідчує про наявність в пробі α-амінокислот.
Якщо густину забарвлення витяжки із нінгідрином виміряти за допомогою колориметра і співставити з густиною забарвленням нінгідрином суміші α-амінокислот відомої концентрації, то можна розрахувати концентрацію α-амінокислот у досліджуваній пробі.
2.3.2 Кількісне визначення амінокислот методом формольного титрування за Серенсеном.
Метод грунтується на здатності амінокислот реагувати з нейтральним розчином формальдегіду з утворенням метиленамінокислот. Цей метод застосовується для визначення карбоксильних груп амінокислот, які титрують розчином лугу, попередньо блокуючи аміногрупи формальдегідом. Під час реак-ції з формальдегідом аміногрупа втрачає основні властивості, вна-слідок чого утворюється метиленамінокислота, яка відтитровується лугом:
Визначаючи кількість карбоксильних груп титруванням, можна одночасно встановити й вміст α -аміногруп, оскільки кількості карбоксильних груп і зв'язаних формальдегідом α -аміногруп еквівалентні.
До 25 мл 1 %-ної суміші амінокислот (витяжка амінокислот із біологічного матеріалу) в колбі додають 1г барію хлориду, 10 крапель розчину фенолфталеїну та перемішують. До суміші приливають насичений розчин баритової води до появи рожевого відтінку. Колбу закривають і залишають на 15 хв. Потім об’єм доводять водою до 100 мл та відфільтровують через складчастий паперовий фільтр від фосфорнокислих і вуглекислих солей барію. Готують дві колби на 100 мл. В одну вносять 40 мл фільтрату, що відповідає 10 мл розчину амінокислот, в іншу – 40 мл дистильованої води. Додають по 10 крапель розчину фенолфталеїну і 0,01 моль/л розчин хлоридної кислоти (обережно) до забарвлення розчинів (проби і контролю) у ледь помітний рожевий колір. У кожну колбу додають по 10 мл формольной суміші і титрують з бюретки 0,05 M розчином гідроксиду калію до появи рожевого кольору. Колір проби і контролю повинен бути однаковий.
Масову концентрацію амінокислот (мг/мл) визначають за формулою:
С = (А-В)fQ/V,
де А і В – об’єми розчину гідроксиду калію, витрачені на титрування проби і контролю (мл); f - коефіцієнт поправки на титр 0,05 моль/л розчину гідроксиду калію; Q - маса амінокислот, еквівалентна 1 мл 0,05 моль/л розчину гідроксиду калію (0,7 мг); V – об’єм розчину амінокислоти взятої для аналізу.