1.3 Експериментальна частина

1.3.1 Біуретова реакція на пептидну групу (реакція Піотровського).

Б іуретова реакція зумовлена наявністю в молекулах білків пептидних зв’язків. У лужному середовищі в присутності йонів двовалентного купруму розчини білків і пептидів набувають фіолетового забарвлення з червоним або синім відтінком залежно від кіль­кості пептидних зв'язків. У сильно лужному середовищі пептидні групи поліпептидних ланцюгів переходять в енольну фор­му, яка взаємодіє з йонами Сu²⁺ і утворює забарвлений біуретовий комплекс:

При цьому енольна форма поліпептиду, утворена в сильно-лужному середовищі, дає негативний заряд, та її оксиген, що взаємодіє з купрумом, утворює ковалентний зв'язок, а при взаємодії з атомами нітрогену, купрум утворює координаційні зв'язки. Таку реакцію дають усі білки, а також пептиди, що містять не менше двох пептидних зв'язків. З ди- та трипептидами за­барвлення нестійке. Біуретову реакцію дають також біурет, деякі амінокислоти (гістидин, серин, треонін, аспарагін) та інші сполуки при досить значній концентрації в розчині. Деякі кислоти, у яких пептидні зв'язки виникають за рахунок карбоксильної та амінної груп (аспарагін) дають біуретову реакцію.

Біурет, що дав назву цій реакції, утворюється при сплавленні двох моле­кул сечовини:

У три пронумеровані пробірки вносять по 1 мл: 1 % розчину яєчного білка; 1 % розчину желатини; 0,1 % розчину амінокислоти гліцину чи аланіну. Добавляють в кожну пробірку по 1 мл біуретового реактиву, ледь збовтують. Спостерігають, чи утворюватиметься синьо–фіолетове забарвлення, дають пояснення (по кожній пробірці) і роблять висновки.

1.3.2 Нінгідринова реакція на α-аміногрупу

Б ілки, пептиди, вільні α-амінокислоти дають синє або синьо-фіоле­тове забарв­лення при взаємодії з нінгідрином (трикетогідринденгідратом). Реакція характерна для аміногруп, що знаходяться в -положенні. α-Амінокислоти при нагріванні до 70°С з нінгідрином перетворюються на альдегіди з виділенням амоніаку і вуглеки­слоти. Нінгідрин при цьому відновлюється:

В ідновлений нінгідрин конденсується з амоніаком та окисненим нінгідрином і утворює сполуку, яка єнолізується і пере­ходить у забарвлену форму, що має синьо-фіолетовий колір:

Нінгідринова реакція з використанням спиртового (або ацетонового) розчину широко використовується в хроматографічному аналізі, а також для колориметричного кількісного визначення, амінокислот (цистеїн, метіонін, глутамінова кислота, гістидин; амінокислот у гідролізатах білків).

В одну пробірку наливають 1 мл 1 % -вого розчину яєчного білка, в другу — 1 мл 0,1 % -вого розчину α-аланіну і в третю –1 мл 0,1% -вого розчину β-аланіну. Приливають у всі пробірки по 5-10 крапель 0,5 % -вого водного роз­чину нінгідрину і нагрівають на водяній бані при температурі 70°С протягом 5 хв. Спостерігають за утворенням забарвлення, порівнюють швидкість утворення забарвлення в кожній пробірці, дають пояснення та записують хімізм реакції.

1.3.3 Ксантопротеїнова реакція на ароматичне кільце циклічних амінокислот (реакція Мульдера).

При взаємодії з концентрованою нітратною кислотою білки, пептиди, що містять залишки циклічних амінокислот з ароматичними кільцями (фенілаланін, тирозин, триптофан), а також вільні вище вказані амінокислоти нітруються з утворенням динітропохідних жов­того кольору, які при додаванні лугу перетворюються на хіноїдні структури, забарвлені в оранжевий колір:

Фенілаланін нітрується важче. Білки, що не містять циклічних аміно­кислот, не дають ксантопротеїнової реакції.

В одну пробірку наливають 1 мл 1 % -вого розчину яєчного білка, в другу – 1мл 0,1 % -вого розчину тирозину, в третю – 1 % -вого розчину желатини, в четверту – 1 мл 0,1% -вого розчину гліцину. Додають до всіх пробірок по 1 мл кон­цен­трованої нітратної кислоти і обережно нагрівають до появи жовтого забарвлення. Потім про­бірки охолоджують під струменем водопровідної води, додають краплинами 20 % -вий розчин натрію гідроксиду, доки не поч­неться зміна забарвлення. Дають пояснення результатам дослі­ду в кожній пробірці, порівнюють забарвленя і записують хімізм реакції.