9.3 Експерементальна частина

9.3.1 Визначення активності аскорбатоксидази в рослинах.

Свіжий рослинний матеріал гомогенізують. До частини гомогенату додають фосфатний буфер з рН 6,4, аскорбінову кислоту і інкубують при 20°С протягом 10 хвилин, рівномірно струшуючи. При цьому аскорбінова кис­лота окиснюється під дією ферменту, що міститься в гомогенаті. Через 10 хвилин припиняють реакцію, додаючи розчин НРО₃ і надлишок аскорбінової кислоти титрують калій йодатом за уча­сті калій йодиду і крохмалю до появи синього забарвлення. Ка­лій йодат у кислому середовищі реагує з калій йодидом, при цьо­му виділяється йод:

КІОз + 5КІ + 6НРОз — ЗІ₂ + 6КРОз+ЗН₂О

Й од, що виділився, вступає в реакцію з аскорбіновою кисло­тою, окиснюючи її в дегідроаскорбінову кислоту:

Визначивши залишок аскорбінової кислоти і знаючи масу аскорбінової кислоти, внесеної в інкубаційну суміш, за різницею знаходять масу аскорбінової кислоти, яка характеризує актив­ність аскорбатоксидази.

Хід роботи: рослинний матеріал (листя, бульби та, ін.) масою 2- 4 г розтирають у ступці з дистильованою водою, суспензію переносять у мірну колбу на 100 мл, доводять водою до риски і ретельно перемішують. Не даючи осаду осісти, відби­рають 20 мл в конічну колбу на 250 мл для визначення активності аскорбатоксидази. Туди ж додають 1 мл фосфатного буфер­ного розчину з рН 6,4, 5 мл розчину аскорбінової кислоти (С(1/2) = 0,04 моль/л) і протягом 10 хвилин струшують кол­бу. Після цього реакцію припиняють додаванням 5 мл 5% розчину метафосфатної чи ортофосфатної кислоти, додають 1 мл 0,5% розчину калій йодиду. Залишок аскорбінової кисло­ти, що не вступив у ферментативну реакцію, титрують розчином калій йодату (С (1/5) = 0,01 моль/л) за участі розчину крох­малю до появи синього забарвлення.

Паралельно проводять контрольне титрування досліджуваного розчину. Для цього відбирають 20 мл досліджуваної суспензії (після попереднього збовтування) у конічну колбу, дода­ють 5 мл 5% розчину мета- чи ортофосфатної кислоти і перемішують. Потім додають 5 мл розчину аскорбінової кислоти (С(1/2) = 0,04 моль/л), 1 мл 0,5% розчину КІ і титру­ють розчином КІО₃ (С(1/5) = 0,01 моль/л) за участі крохмалю до появи синього забарвлення.

Активність аскорбатоксидази розраховують за формулою:

А=

де А - активність аскорбатоксидази (у мкмоль аскорбінової кислоти, окис­неної за 1 хвилину при 20С ферментом з 1 г досліджуваного матеріа­лу);

V₁ - загальний об'єм суспензії досліджуваної тканини, мл;

а - об'єм розчину КІО₃ (С(1/5) = 0,01 моль/л), витрачений на титрування контрольної проби, мл;

b - об'єм розчину КІОз (С(1/5) = 0,01 моль/л), витрачений на титрування досліджуваної проби, см³;

V₂ -об'єм суспензії, взятий для визначення активності аскорбатоксидази, мл; і - час дії ферменту, хвилин;

п - маса дослі­джуваного матеріалу, г;

Т - титр розчину КІО₃ (С(1/5) = 0,01 моль/л) за аскорбіновою кислотою, мг/мл (1,096 мг/мл);

т - мікромоль аскорбінової кислоти (0,176 мг/моль).