3.3.6. Алгоритм лікування геморагічного синдрому неясного ґенезу.

При розвитку геморагічного синдрому неясної етіології і підозрі на патологію в коагуляційній ланці гемостазу (дані анамнезу, хронічні кровотечі, показники скринінгових тестів) лікування рекомендується починати з внутрішньовенного введення 200 - 400 мл (залежно від маси тіла та характеру геморагічного епізоду) антигемофільної або свіжозамороженої плазми, адже лише ці препарати крові містять всі фактори згортання крові. Враховуючи те, що найкоротший період напіврозпаду фактора (ф. VІІ) становить 4 години, наступне введення АГП або СЗП необхідно проводити саме через 4 години.

Якщо після повторного введення вище вказаних препаратів кровотеча не зупиняється, слід запідозрити наступні порушення: тромбоцитопенію, тромбоцитопатію; патологію у фібринолітичній системі; передозування антикоагулянтів, глибокий дефіцит вітамину К; ДВЗ-синдром – стадія (фаза) гіпокоагуляції. У таких випадках додатково призначають антифібринолітичні препарати (амінокапронова кислота, ПАМБА, транексамова кислота, екзацил – на вибір); препарати, які підвищують агрегацію тромбоцитів - великі дози етамзилату (діцинону), вітаміна К (вікасолу).

ПАМБА – відноситься до групи препаратів з амінокапронової кислоти, яка за антифібринолітичною активністю сильніша за неї. Інгібітори фібріноліза мають велике значення для купування геморагічних ускладнень, обумовлених системною активацією фібринолізу (злоякісні пухлини, гостра промієлоцитарна лейкемія, спадкова чи набута гіпоантиплазмінемія). Препарат опосередовано підвищує адгезівні та агрегаційні властивості тромбоцитів. Призначається вона по 250 мг усередину 3 - 4 разів на добу. При гострій генералізованій фібринолітичній кровотечі 50,0 – 100,0 мг препарату вводять внутрішньовенно чи внутрішньом’язово. В таблиці 17 наведені деякі хвороби та патологічні стани, перебіг яких може супроводитися геморагічними ускладненнями, при яких показано призначення ПАМБи.

При відсутності ефекту від проведеної гемостатичної терапії препаратом вибору є рекомбінантний активований концентрат VІІ фактора згортання крові (НовоСевен), який вводиться в дозі 45 - 120 мікрограм на 1 кг маси тіла хворого при дворазовому внутрішньовенному введенні (друге введення проводиться через 2 години після першого).

Таблиця 17

Клінічні ситуації і стани, при яких показане застосування ПАМБи

Область медицини	Захворювання і патологічні стани
Акушерство	Передчасне відшарування нормально розташованої плаценти; тривала затримка в матці мертвого плоду; уповільнена інволюція матки; після медичного аборту, ручного відділення плаценти; емболія амніотичною рідиною.
Гінекологія	Профілактика кровотеч після гінекологічних операцій; метрорагіі неясної етіологіі; менорагіі (первинні і зв’язані з застосуванням внутриматкових протизаплідних засобів); ювенільні маткові кровотечі.
Хірургія (профілактика кровотеч)	Операції на легенях, серці, предміхрової, підшлункової, щитовидної залозах, органах грудної порожнини; виразкова хвороба шлунка та дванадцятипалої кишки; виразковий коліт.
Отоляринго- логія	Тонзілектомія; кровотечі з носа неясної етіології; оперативні втручання в порожнині носа
Гематологія: системна патологія крові, патологія системи гемостазу	Хвороба і синдром Верльгофа; лейкеміі, апластична анемія; В12-дефіцитна анемія. Дефіцит (або зниження активності) факторів коагуляційної ланки гемостазу (гемофілії А, В, С; гіпо-, а- і дисфібриногенемії, гіпо- та апроконвертинемії, гіпоакцеллеринемія, гіпопротромбінемія, хвороба Стюарта-Прауера (дефіцит X фактора), хвороба Віллебранда; дизагрегаційні тромбоцитопатії (хвороба Мей-Хеглина, Гланцмана та інш.); збільшення активності протизсідаючої системи; гіперактивація фібриноліза; передозування антикоагулянтів, фібринолітичних препаратів (стрептокіназа, урокіназа та інші).
Стоматологія	Екстракція зуба (зубів); ясневі кровотечі; стоматологічні операції.
Терапія	Гепатити; цироз печінки; гострий панкреатит; дизбактеріоз; холангіт.
Загальна медична практика	Сепсис (в особливо визваний коковою інфекцією); введення великих обсягів еритроцитної маси, при небезпеці развитку вторинної гіпофібриногенемії; алергоз; спадковий ангіоневротичний набряк.

Контрольні запитання:

1. Система гемостазу.

2. Перелічити плазмові фактори зсідання крові.

3. Схема зсідання крові.

4. Система фібринолізу і антикоагулянти.

5. Типи кровоточивості. Клінічні особливості кожного з них.

6. Дослідження судинно-тромбоцитарної ланки гемостазу.

7. Глобальні скринінглві лабораторні методи дослідження плазмової ланки гемостазу. Відповідність їх фазам зсідання крові.

8. Спеціальні диференціально-діагностичні методи дослідження системи гемостазу.

9. Диференційна діагностика при петехіально-плямистому (синцевому) типі кровоточивості?

10. Диференційна діагностика при гематомному типі кровоточивості?

11. Диференційна діагностика геморагічних захворювань при змішаному плямисто-гематомному типі кровоточивості?

12. Для яких хвороб характерним є васкулітно-пурпурний тип кровоточивості?

13. Клініка, лабораторна діагностика, терапія тромбоцитопеній, тромбоцитопатій.

14. Гемофілія. ЇЇ види, особливості клінічної картини, лабораторна діагностика, терапія.

15. Дефіцит факторів протромбінового комплексу. Клініка, диференційна діагностика, терапія.

16. Дефіцит фібриногену. Клініка, лабораторна діагностики, терапія.

17. Хвороба Віллебранда. Клініка, лабораторна діагностики, терапія.

18. Клінічні особливості геморагічного синдрому при передозуванні антикоагулянтами непрямої дії. Лабораторні дослідження, корекція їх порушень.

19. Клінічні особливості геморагічного синдрому при передозуванні гепарином. Лабораторні дослідження, корекція їх порушень.

20. Геморагічний синдром при лікуванні фібринолітиками та декстранами. Лабораторна діагностика, терапія.

21. ДВЗ-снндром. Клініка, фази розвитку, лабораторна діагностика, терапія.

22. Геморагічний васкуліт. Клінічні варіанти, лабораторна діагностика, терапія.

23. Хвороба Рандю-Ослера. . Клінічні варіанти, лабораторна діагностика, терапія.

24. Сучасні технологіі в лікуванні геморагічного синдрому.

25. Препарати гемостатичної дії.

26. Гемокомпонентна терапія при геморагічному синдромі. Показання до призначення препаратів крові.

Завдання для самоконтролю:

1. Жінка, 23 років, скаржиться на підвищення температури тіла до 37,4 °С, появу геморагічної висипки на нижніх кінцівках, біль у попереку, появу червоної сечі. Захворіла 3 дні тому після переохолодження. Об'єктивно: шкіра бліда, на поверхні гомілок і стегон спостерігається дрібна геморагічна симетрична висипка. ЧСС - 90 за 1 хв, АТ - 115/90 мм рт. ст. Симптом Пастернацького слабко позитивний з обох боків. У крові: л. — 9,6 • 10 ⁹/л, тр. - 115 • 10 ⁹ /л, ШОЕ - 31 мм/год. Аналіз сечі: білок — 0,33 г/л, ер. змінені - 30-40 у полі зору, л. – 5-8 у полі зору. Який з наведених препаратів є патогенетично обгрунтованим для лікування в даному випадку?

А.Рутин. D. Вікасол.

В. Кальцію глюконат. Е. Гепарин.

С. Аскорбінова кислота.

2, Жінка, 61 року, вперше звернулася до лікаря зі скаргами на часті носові кровотечі, появу синців на тілі, хворіє більше ніж 3 міс. Після обстеження встановлено діагноз: ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура. З чого найбільш доцільно почати лікування хворої?

А. Із призначення імуноглобулінів.

В. Негормональних імунодепресантів.

С. Глюкокортикоїдів.

D. Спленектомії.

Е. Трансфузій концентрату тромбоцитів.

3. До гематологічного відділення госпіталізовано юнака, 16 років, зі скаргами на біль у правому плечовому суглобі, який виник після забою. З анамнезу відомо, що така клінічна картина спостерігалася неодноразово з раннього дитинства. Об'єктивно: суглоб збільшений в об'ємі, різко болючий під час пальпації, У крові: ер.- 3,7•10¹²/л, Hb - 110 г/л, тр. - 115*10⁹/л, л.- 6,9*10⁹/л, ШОЕ – 25 мм/год, протромбіновий індекс - 90 %, час згортання крові - 38 хв, фібриноген - 3,5 г/л. Який найбільш імовірний діагноз?

А. Геморагічний васкуліт.

В. Імунна коагулопатія.

С. Тромбоцитопатія.

D. Імунна тромбоцитопенія.

Е. Гемофілія.

4. У хворої, 27 років, скарги на кровотечі з ясен, носу, множинні синці на шкірі передньої поверхні тулуба і кінцівок, різка загальна слабкість. На протязі 2-х місяців приймала 60 мг преднізолону. У крові: ер. - 2,5*10¹²/л, НЬ - 64 г/л, рц- 16 %, тр.- 30*10⁹/л, ШОЕ - 25 мм/год. Що є найбільш ефективним у лікуванні даної патології?

А. Переливання крові. Д. Цитостатики.

В. Кортикостероїди Е. Вітаміни.

С. Спленектомія.

.

5. Хлопчик, 14 років, скаржиться на раптовий біль, що з'явився після забою, та припухлість у правому колінному суглобі. В анамнезі часті носові кровотечі, синці на шкірі після мікроударів. Об'єктивно: шкіра бліда, із слідами множинних крововиливів. Правий колінний суглоб набряклий, гарячий на дотик, рухи у суглобі болючі. Лімфатичні вузли не збільшені. Печінка та селезінка не пальпуються. У крові: ер. - 3,5*10¹²/л, НЬ - 105 г/л, л.- 6,8*10⁹/л, ШОЕ - 14 мм/год. Коагулограма: подовження частково активованого тромбопластинового часу, протромбіновий час та тривалість кровотечі - у межах норми. Рівень VIII фактора - 2 %. Який із діагнозів найбільш імовірний?

А. Геморагічний васкуліт.

В. Гемофілія В.

С. Тромбоцитопенічна пурпура.

D. Гемофілія А.

Е. Синдром дисемінованого внутрішньосудинного згортання.

6. Дівчина, 18 років, скаржиться на загальну слабкість, запаморочення, зниження апетиту, менорагії. Об'єктивно: на шкірі верхніх кінцівок петехії різного кольору. В крові: НЬ - 105 г/л; ер.- 3,1*10¹²/л, КП - 0,75, тр. - 50* 10⁹/л. Час згортання крові за Лі-Уайтом - 5 хв; тривалість кровотечі за Дуке - 8 хв, проби щипка та джгута - ( + ). Який діагноз найбільш імовірний ?

А. Ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура.

В. Гемофілія.

С. Геморагічний діатез.

D. Залізодефіцитна анемія.

Е. Хвороба Маркіафави—Мікелі.

7. Хвору, 20 років, доставлено до стаціонару з приводу кровотечі після екстракції зуба. Аналіз крові: ер.- 2,8•10¹²/л, НЬ - 80 г/л, л. - 4,0х10⁹/л, е. - 2 % п. – 3%, с. - 62 %, лімф. - 28 %, мон. - 5 %, тр. - 24 • 10⁹/л, ШОЕ - 25 мм/год. Який найбільш імовірний діагноз ?

А. Апластична анемія. D. Агранулоцитоз.

В. Гострий лейкоз. Е. Тромбоцитопенічна пурпура.

С. Гемофілія В.

8. У дівчинки, 8 років, на шкірі гомілок сідниці, навколо ліктьових суглобів симетричне папульозно-геморагічне висипання, місцями злите; біль у животі, блювання, набряки та біль суглобів. Який тип кровоточивості ймовірніше має місце у дитини?

A. Гематомний. D. Васкулітно-пурпурний.

B. Петехіально-плямистий. E. Ангіоматозний.

C. Змішаний.

9. Чоловіка, 68 років, госпіталізовано з ознаками геморагічного синдрому на фоні септичного стану. Які з препаратів найбільш доцільно призначити для купування кровотечі?

A. Свіжозаморожена плазма. D. Поліглюкін.

B. Протамінсульфат. Е. Реополіглюкін.

C. Гепарин.

10. Жінка, 28 років, звернулася до лікаря зі скаргами на появу геморагій після незначних травм або спонтанно на шкірі передньої поверхні тулуба та кінцівок, які з'явились кілька місяців тому. Об'єктивно: строката шкіра, свіжі і старі геморагії, позитивні симптоми джгута і щипка, кровотечі з ясен. У крові: тр. - 20*10⁹/л; у кістковому мозку збільшена кількість мегакаріоцитів і відсутнє відшнуровування тромбоцитів; відсутня ретракція кров'яного згустка - сироватка не відділяється. Проведене лікування стероїдними гормонами дало позитивний ефект. Яке найвірогідніше захворювання в жінки?

А. Геморагічний васкуліт.

В. Ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура.

С. Хвороба Рандю—Ослера.

D. Гемофілія.

Е. ДВЗ-синдром.

11. Жінка, 23 років, скаржиться на підвищення температури тіла до 37,4 °С, появу геморагічної висипки на нижніх кінцівках, біль у попереку, появу червоної сечі. Захворіла 3 дні тому після переохолодження. Об'єктивно: шкіра бліда, на поверхні гомілок і стегон — дрібна геморагічна симетрична висипка. ЧСС - 90 за 1 хв, АТ - 115/90 мм рт. ст. Симптом Пастернацького — слабкопозитивний з обох боків. Аналіз крові: л. - 9,6*10⁹/л, тр. - 115*10⁹/л, ШОЕ - 31 мм/год. В сечі: білок - 0,33 г/л, ер. змінені – 3 - 40 у полі зору, л. – 5 - 8 у полі зору. Який найбільш імовірний діагноз ?

А Системний червоний вовчак.

В. Вузликовий периартеріїт.

С. Геморагічний васкуліт.

D. Тромбоцитопенічна пурпура.

Е. Гострий інтерстиціальний нефрит.

12. Підліток, 13 років, який хворіє на гемофілію А, після бійки в школі потрапив до лікарні. Діагностовано правобічний гемартроз колінного суглоба, позаочеревинну гематому. Що слід призначити хворому в першу чергу?

А. Свіжозаморожену плазму.

В. Відмиті тромбоцити.

С. Кріопреципітат.

D. Альбумін плацентарний.

Е. Амінокапронову кислоту.

13. Хвора, 28 років, скаржиться на загальну слабкість, носові кровотечі, крововиливи на тулубі. Хворіє 4 міс. Об'єктивно: стан середньої тяжкості. На шкірі живота та спини визначаються крововиливи розміром 1 - 2 см різного кольору, безболісні. Периферійні лімфатичні вузли не збільшені, з боку серця та легень патології не виявлено. Печінка та селезінка не збільшені. Аналіз крові: НЬ - 80 г/л, ер. - 2,4*10¹²/л, КП - 0,8, рц - 0,9 %, залізо сироватки - 14,01 мкмоль/л, л. - 4,2*10⁹/л, е. - 2 %, б. - 0 %, п. - 7 %, с. - 40 %, мон. - 6 % лімф. - 45 %, тр. - 47,1•10⁹/л, ШОЕ - 27 мм/год. Який найімовірніший діагноз?

А. Ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура.

В. Гемолітична анемія.

С. Хронічна залізодефіцитна анемія.

D. Хронічний лімфолейкоз.

Е. Гіпопластична анемія.

14. Хворий, 18 років, госпіталізований з кровотечею з різаної рани на долоні, що триває 2 доби. Тривалі кровотечі спостерігались і раніше: при порізах, зміні зубів. Подібні явища спостерігаються у двоюрідного брата по лінії матері. Шкірні покриви бліді. На правій руці пов'язка змокла від крові. Колінні та гомілково-стопні суглоби збільшені, деформовані, рухи в них обмежені. Лабораторно: тр. - 320*10⁹/л, тривалість кровотечі за Дюке - 3 хв, час згортання крові за Лі-Уайтом - 20 хв. Яке лікування слід призначити в першу чергу?

А. Гепарин. D. Тромбоцитарна маса.

В. Кріопреципітат. Е. Дицинон.

С. Преднізолон.

15. Після пологів у жінки, 28 років, протягом 3 годин продовжується кровотеча з полових шляхів червоного кольору. Кров у судочку не зсідається. Раніше ніяких геморагічних проявів у жінки не було. В аналізі крові анемія, тромбоцитопенія. Всі показники коагулограми подовжені. Яка патологія гемостазу є причиною кровотечі?

А. Тромбоцитопенічна пурпура.

В. Гемофілія А.

С. ДВС-синдром, фаза гіпокоагуляції.

D. Афібриногенемія.

Е. Хвороба Віллебранда.

16. У жінки, 48 років, на фоні післяопераційного прийому сінкумару з’явились поширені крововиливи на ніжних кінцівках. Призначення якого препарату перш за все необхідно?

А. Дицинон. D. Амінокапронова кислота.

В. Вікасол. Е. Препарати кальцію.

С. Аскорбінова кислота.

Вірні відповіді:

1. Гепарин. 2.. Глюкокортикоїдів. 3. Гемофілія. 4. Спленектомія. 5. Гемофілія А. 6. Тромбоцитопенічна пурпура. 7. Тромбоцитопенічна пурпура. 8. Васкулітно-пурпурний. 9. Свіжозаморожена плазма. 10. Ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура. 11. Геморагічний васкуліт. 12. Кріопреципітат. 13. Ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура. 14. Кріопреципітат. 15. ДВС-синдром, фаза гіпокоагуляції. 16. Вікасол.

ДОДАТОК 1. Методи лабораторної діагностики анемій

Визначення об’єму еритроцитів (гематокритне число)

Гематокритне число, як показник, дає уявлення про співвідношення між об’ємами плазми та формених елементів крові (в основному еритроцити). Цей показник відображує об’єм еритроцитів у крові, отриманий після її центрифугування. Використовують методику за допомогою уніфікованого методу з використанням центрифуги.

Попередньо оброблені антикоагулянтом та висушені спеціальні скляні капіляри заповнюють кров’ю з пальця чи з вени на 7/8 довжини. Закупорюють з одного боку спеціальною пастою чи пластиліном, вміщують в ротор центрифуги та центрифугують 5 хвилин при 8000 об./хв. За спеціальною шкалою, що додається до центрифуги МЦГ-8, визначають гематокритне число. Нормальні значення його становлять для чоловіків 0,40 - 0,48, а для жінок - 0,36 - 0,42.

Показник використовують для оцінки ступеня виразності анемії чи еритроцитозу, оскільки він є наслідком гемоконцентраційних зрушень. Знижується при гемоділюції.

Методика виявлення неорганічного заліза ( perls)

Визначення вмісту заліза в кістковому мозку дає цінну інформацію для оцінки накопичення заліза в організмі. Однією з класичних методик виявлення неорганічного заліза є метод Perls із фарбуванням мазків берлінською блакиттю. Реакція супроводжується утворенням осаду ферифероцианіду, що має синій або синьо-зелений колір. В нормі великі зерна або комплекси забарвленого в синій колір заліза спостерігають в ретикулоендотеліальних клітинах кісткового мозку, або ж як вільно розміщені між клітинами. Зерна малих розмірів спостерігають в молодих клітинах еритроідного ряду. При залізодефіцитних анеміях визначають збіднення запасів заліза в названих клітинах, при чому, існує прямо пропорційна залежність глибини дефіциту заліза та кількості гранул в фарбованих клітинах кісткового мозку. Надмірне накопичення заліза спостерігається у хворих на ідиопатичний та набутий гемохроматоз, гемолітичні анемії, таласемії, а також – на рефрактерну анемію із надлишком сидеробластів (форма мієлодиспластичного синдрому).

Визначення залізозв’язуючої здатності сироватки крові

Принцип визначення базується на насиченні трансферииу. що міститься у сироватці крові розчином трьохвалентного заліза. Надлишок солей заліза вилучають адсорбцією на карбонаті магнію, а потім приступають до визначення показника.

Хід визначення. До 2,0 мл сироватки крові додають до 4.0 мл розчину хлорного заліза та ретельно перемішують. Через 5 хвилин додають порошок магнію карбонату в обсязі 0,5 мг, струшують 10 - 15 секунд, потім центрифугують. В надосадовій рідині визначають чають вміст заліза за наведеною вище методикою, проводять аналогічні розрахунки, отриманий результат множать на 3 (ступінь розведення сироватки). Нормальне значення показника зaлiзoзв’язуючої здатності сироватки складає у чоловіків 35 - 84 мкмоль/л, у жінок показник на 10 - 15% нижчий.

Клінічне значення: показник зростає при залізодефіцитних станах — латентному дефіциті заліза та залізодефіцитній анемії.

Лабораторна діагностика порушень вмісту трансферину

Для діагностики порушень обміну заліза в клініко-біологічній практиці прийнято використовувати такі тести як рівень сироваткового заліза, показник загальної та латентної залізо­зв'язуючої здатності сироватки крові, відсоток сатурації трансферина залізом, вміст трансферина та феритина у сироватці крові Співвідношення показника вмісту заліза у сироватці та загальної залізозв'язуючої здатності сироватки крові характеризує наси­чення трансферину залізом (норма 16 - 50%). При залізодефі­цитній анемії даний показник зменшується. Вміст трансфе­рина у сироватці крові здорових осіб складає 2 - 4 г/л, або 23 - 45 мкмоль/л, показник збільшується при залізодефіцитній анемії. Насичення трансферина залізом можна вираховувати і за такою методикою:

- Насичення трансфеина залізом (%) = вміст заліза у сироватці (мкг/дл) поділений на множення вмісту трансферина у сироватці крові (мг/дл) на коефіцієнт 1,41 та множення на 100%.

Існують певні співвідношення між вмістом трансферина у сироватці крові та показником загальної залізозв'язуючої здатності сироватки крові. Наводимо деякі формули для здійснення розрахунків:

- вміст трансферина у сироватці крові (мкмоль/л) помножений на 2 = загальна залізозв'язуюча здатність сироватки крові (мкмоль/л);

- вміст трансферина у сироватці крові (мг/дл) помножений на 1,25 = загальна залізозв'язуюча здатність сироватки крові (мкг/дл);

- вміст трансферина у сироватці крові (мг/дл) помножений на суму від поділу 2 множене на 56000 та ділене на 88000 = загальна залізозв'язуюча здатність сироватки крові (мкг/дл).

Останнім часом, з впровадженням імунохімічних методів до­слідження, визначають і рівень трансферина. Визначення типів трансферина, в основному, проводиться за допомогою електро­форезу в горизонтальному крохмальному гелі з використанням переривчастої буферної системи. Розмежування групових ком­понентів сироваткового трансферина проводять методом електро­форезу в поліакриламідному гелі та гелі агарози. Остання методика дозволяє одночасно в одному гелевому блоці визначати типи трансферина і групові компоненти комплементарної системи СЗ комплемента. На підставі цієї методики було ус­тановлено гетерогенність сироваткового трансферина і зроблена номенклатура його генетичне детермінованих варіантів. Засто­сування методу ізоелектричного фокусування в поліакрила­мідному гелі, гелі агарози дозволяє визначати підтипи транс­ферина.

Для ідентифікації рецепторів трансферину на поверхні клітин застосовують наступні методи: виявлення мічених флюоресцином антитіл до трансферину на поверхні клітин після обробки клітин; зв'язування міченого радіоактивними ізотопами трансферину, радіоімунний аналіз з застосуванням моноклональних антитіл проти CD71. Імунофлюоресцентні методи мають ту перевагу, що дають можливість в суспензії (суміші) клітин виявити клітини, що здатні зв'язувати трансферин. Недоліком цих методів є неможливість кількісної оцінки рецепторів. До­слідження зв'язування міченого радіоізотопами трансферина дозволяє отримувати кількісні параметри рецепторів трансфе­рина. Переваги обох названих методів поєднує у собі радіоімунний аналіз із використанням моноклональних антитіл анти-СD71. Але при його застосуванні теж слід пам'ятати, що існує пул рецепторів трансферина, не представлений на поверхні клітин. Сучасна наука дозволяє здійснювати структурний, аміно­кислотний, вуглеводний аналіз як трансферина так і очищених рецепторів трансферина, вивчати їх функціональні властивості, проводити генетичні дослідження.

Лабораторна діагностика порушень вмісту феритину

В стані фізіологічної рівноваги рівень феритину в плазмі корелює із запасами заліза в організмі. Встановлено, що в сиро­ватці крові дорослого 1 мкг/л феритина в нормі відповідає близько 8 мг депонованого заліза. У здорових дорослих осіб рівень фери­тину в сироватці крові залежить від статі і в меншій мірі віку. Вміст феритину у сироватці здорових людей є наступним: у чоловіків - 15 - 200 нг/мл, жінок - 12 - 150 нг/мл, немовлят – 25 - 250 нг/мл, у дітей віком 1 міс. - 200 - 600 нг/мл, 2 - 5 міс. – 50 - 200 нг/мл, 6 міс. - 16 років – 12 - 140 нг/мл. При залізодефіцитній анемії вміст феритину у сироватці зменшується понад означені нижні межі нормальних значень. В постменопаузі рівень феритина у жінок зрівнюється із показниками у чоловіків аналогічного віку. Існують добові ритми зміни рівня феритину в сироватці крові.

Концентрацію феритина в наш час визначають імунохімічнимн методами. Імунохімічне визначення вмісту феритина може прово­дитись на підставі принципово відмінних типів аналізу: радіоімунного (РІА), імуноферментного (ІФА), імунофлюорисцентного (ІФЦА) та хемілюмінісцентного (ХЛА).

Принцип РІА базується на зв'язуванні феритина з антитілами, іммобілізованими на твердофазному носії з наступним його реагуванням з міченими йодом-125 антитілами. Мічені, але непрореаговані з феритином антитіла залишаються в розчині і вилучаються. Гама-лічильник вимірює радіоактивність комплек­су: мічене антитіло-феритин-іммобілізоване антитіло. Виміряна радіоактивність зразка пропорційна кількості феритину ньому.

Принцип ІФА базується на використанні антитіл кон'югованих із ферментами. Результат визначення ФН при ІФА залежить від імунохімічної конструкції аналітичної системи, а саме від ізоформи феритину, яка використана як імуноген для отримання антитіл.

ІФЦА і ХЛА основані на використанні явища люмінісценції для виявлення реакції антиген-антитіло, або детекції молекул, мічених флюоресцентною міткою.

Методи ІФЦА та ХЛА є чутливими, дозволяють виявляти рівень феритину в широкому діапазоні концентрацій: від 0,5 -1 мкг/л до 2000 мкг/л, але є дороговартісними, що обмежує їх впровадження. Для вивчення кінетики феритина застосовують радіологічні методи з використанням ізотопів заліза-59. В сучасній онкологічній практиці застосовують визначення рівня ФН із паралельним підрахунком кількості феритин-зв'язуючих лімфоцитів (FBL), оскільки при ряді онкозахворювань з'являється субпопуляція Т-лімфоцитів, здатних зв'язувати саме онкофетальний Н-феритин. Встановлена відповідність між FBL-тестом і стадіями раку молочної залози, легень, лімфом, лімфогрануломатоза.

Визначення діаметру і сферичності еритроцитів

Прямий мікроскопічний метод.

Вимірювання проводять у мазку крові, фіксованому і зафарбованому будь-яким методом, з викорис­танням окуляр-мікрометра і об’єктива-мікрометра.

Окуляр-мікрометр - кругла скляна пластинка з нанесеною на неї по її діаметру шкалою, розділеною на 50 поділок, ціна яких залежить від властивостей мікроскопу. Об’єктив-мікрометр являє собою предметне скло з нанесеною на ньому шкалою довжиною 2 мм, розділеною на 200 частин (одне поділка дорівнює 10 мкм). Спочатку визначають ціну однієї поділки окуляр-мікрометра, для чого окуляр-мікрометр і об’єктив - мікрометр встановлюють так, щоб їх шкали співпадали. Потім відраховують число поділок окуляр-мікрометра, які співпадають з тією чи іншою кількістю поділок об’єктив-мікрометра. Наприклад, 20 поділок окуляр-мікрометра співпадають із трьома поділками об'єктив-мікрометра, отже, звідси випливає, що ціна однієї поділки окуляр-мікрометра становить 1,5 мкм (20 поділок відповідає 30 мкм, а одне поділка становить 1,5 мкм).

Потім на столик мікроскопа кладуть зафарбований мазок крові і, знаючи ціну однієї поділки окуляр-мікрометра, вимірюють діаметр 200 - 500 різноманітних еритроцитів. Результати розміщують групами в залежності від величини діаметру і встановлюють у відсотках відносну чисельність кожної групи. Прямий мікроскопічний метод вимірювання діаметру еритроцитів занадто трудомісткий, потребує багато часу, а тому він поступається місцем електронно-автоматичному.

У нормі еритроцитометрична крива (Прайс-Джонса) має пік на 7,2 мкм з вузькою основою на 6 - 9. У здорових людей еритроцити залежно від діаметру розподіляються таким чином: нормоцити (діаметр 7,0 - 8,0 мкм) – 68%, мікроцити (діаметр 6,9 мкм та менше) – 15,2%, макроцити (діаметр 8,0 та понад мкм ) – 16,8%.

Результати еритроцитометрії є важливим показником для уточнення характеру анемії. Так, для залізодефіцитної анемії властивим є зміщення еритроцитометричної кривої вліво, має місце макроцитоз. Збільшення відсотку мікроцитів є характерним для спадкового мікросфероцитозу, отруєння свинцем, таласемії. Збільшення відсотку макроцитів може бути ознакою макроцитарної анемії, що обумовлена дефіцитом В12- та фолієво-дефіцитної анемій. Кількість макроцитів при даній патології сягає до 50% і понад, можуть виявитися і мегалоцити діаметром понад 12 мкм. Макроцитоз спостерігають при алкоголізмі, дифузних ураженнях печінки.

Слід зауважити, що в період активації компенсаторно-пристосовних механізмів адаптації організму до гіпоксії у хворих на анемії зростає кількість макроцитів, як наслідок механізмів, спрямованих на збільшення кількості переносників кисню - еритроцитів та вмісту в них білка-гемоглобіну. Виснаження ж цих механізмів призводить до появи макроцитозу.

Кислотна еритрограма (метод Терскова - Гітельзона)

У нормі еритроцитам властива та чи інший ступінь кислотостійкості: для молодих клітин - вищий, для старих - нижчий. Розподіл еритроцитів за стійкістю до часу дії кислоти називається кислотною еритрограмою. Зображена графічно еритрограма має у нормі стабільну форму, початок масового гемолізу відповідає 3-й хвилині дії кислоти, максимум розпаду еритроцитів за висотою дорівнює 16,5 % і відбувається на 4 - 5 хвилині; продовжується гемоліз 8 - 10 хвилин.

Кислотостійкість еритроцитів залежить від структури їх оболонки, яка у нормі змінюється відповідно віку клітини. Звідси розміщення еритроцитів в залежності від віку клітин відносно стійкості до дії кислоти. У здоро­вих осіб більш молоді клітини, як більш стійкі, створюють праву половину графіка, в мірі старіння пере­ходять у ліву - близьку до початку гемолізу. Зміни вікового складу еритроцитів, які спостерігаються при гемолітичних анеміях, а саме перевага у крові молодих еритроцитів, гіперретикулоцитоз - звичайно супровод­жуються відхиленням кислотної еритрограми від норми.

На цьому побудоване використання кислотної еритрограми у ролі тесту гемолізу. Проте, гемоліз веде не лише до посилення еритропоезу і надходження у кров більшого, ніж у нормі, числа молодих еритроцитів, але й до зміни якості продукції, до пошкодження еритроцитів у току крові. Через це порушується чітка вікова залежність побудови еритроцитів. Звідси у свою чергу порушується існуюча у нормі вікова залежність кислотної еритрограми. Тому не завжди посилення еритропоезу і гіперретикулоцитоз у периферичній крові супроводжуються зростанням кислотостійкості еритроцитів і ступінь зростання кислотостійкості паралельна ступені гіперретикулоцитозу.

При кожному різновиді гемолітичної анемії склад еритроцитів, їх структура можуть змінюватися закономірно. Це підтверджується постійністю, специфічністю форми кислотної еритрограми при деякому різновиді гемолітичних анемій, що дає змогу використовувати тест як диференційно-діагностичний.

Апаратура: фотоелектроколориметр (типу ФЕК-М або ФЕК-МН), ультратермостат, кювета із плексигласу з подвійними стінками, моторчик Уорена, розчин соляної кислоти 0,002 н. і фізіологічний розчин.

Хід дослідження. Після проколу пальця голкою Франка беруть 2 - 3 краплини крові і переносять у пробірку з 3 - 4 мл фі­зіологічного розчину (0,85% розчин NаС1). Для отримання стандартної концентрації еритроцитів кров у спеціальній кюветі, розташованій у лівому пучку світла фотоелектроколориметру, розводять фізіологічним розчином до оптичної щільності 0,700. Із цієї суміші відміряють 2 мл і змішують з 2 мл 0,02 н. розчину соляної кислоти у фізіологічному розчині. І.А. Терсков та І.І. Гітельзон запропонували користуватися 0,004 н. розчином соляної кислоти, однак в подальшому було доведено (А.І. Воробйов), що у клініці доцільніше користуватися 0,02 и. розчином.

Кювета, у якій проходить гемоліз, склеєна із органічного скла і має подвійні стінки; між ними цирку­лює вода, яка подається від ультратермостата. Цим досягається постійність температури у кюветі: 24^о ± 0,3. Після змішування суміші з кислотою починається гемоліз. Зменшення кількості клітин визначають за зниженням оптичної щільності суміші. Підрахунок показників фотоелектроколориметра проводять кожні 30 секунд. Визначення ведуть при червоному світлофільтрі. Падіння оптичної щільності суміші у кожну одиницю часу прямо пропорційне відсотку клітин, що розпалися за цей період під дією гемолізуючого розчину.

Визначення теплової резистентності еритроцитів

Для дослідження беруть 5,0 мл венозної крові та ставлять в термостат на 12 годин при температурі + 37^о С. Якщо відбувається тепловий гемоліз еритроцитів, то сироватка забарвлюється в рожевий колір. Інтенсивність забарвлення залежить від ступеню гемолізу. Поява теплового гемолізу властива для еритроцитів хворих на хворобу Маркіафаві-Мікелі (набуте клональне руйнування гемопоетичних стовбурових клітин внаслідок соматичної мутації). В нормі забарвлення сироватки не змінюється.

Визначення аутогемолізу (спонтанного гемолізу після добової інкубації при 37^ос)

При деяких різновидах спадкових гемолітичних анемій еритроцити крові, розташовані на одну-дві доби у стерильних умовах при 37^оС спонтанно гемолізуються. У нормі спонтанний гемоліз практично майже не спостерігається. Глюкоза і АТФ, додані до крові, зменшують ступінь гемолізу по-різ­ному, в залежності від характеру ферментного дефекту еритроцитів.

Апаратура і обладнання: спектрофотометр СФ-4 або фотоколориметр ФЕК-М, термостат на 37^оС, бокс для проведення роботи в стерильних умовах, колба із вставленою в неї через стерильну ватно-марлеву пробку паличкою із скляними шипами на кінці.

Реактиви: розчин глюкози 10% на фізіологічному розчині. До 60 мл стерильного фізіологічного розчину до­бавляють 20 мл стерильної ампульної 40 % глюкози; 0,85 % розчин повареної солі, стерильний; АТФ 0,02 М розчин. 0,1112 г АТФ розчиняють в 10 мл стерильного фізіологічного розчину. Розчин нейтралізують 0,01 н. розчином їдкого натрію, виготовленого із 1 н. розчину їдкого натрію на стерильному фізіологічному розчині.

Хід дослідження. Дефібринована кров або кров, взята із гепарином, розливається стерильно у пробірки, які містять АТФ і глюкозу. Порівнюють інтенсивність гемолізу після 48-годинної інкубації в залежності від додавання до середовища глюкози і АТФ.

Аналіз: 12 - 15 мл венозної крові вміщують у стерильну суху колбу із вставленою в неї через стерильну ват­но-марлеву пробку скляною паличкою із скляними шипами на кінці. Кров дефібринують обережними помішуваннями цією скляною паличкою 10 - 15 хвилин. Дефібриновану кров у стерильних умовах розливають по 2 мл у три малі пробірки із притертими пробками. У першу пробірку додають 0,1 мл фізіологічного розчину, у другу - 0,1 мл розчину глюкози на фізіологічному розчині, у третю пробірку - 0,1 мл 0,02 М розчину АТФ на фізіологічному розчині.

Із крові, яка залишилася, 0,1 мл розбавляють 20 мл 0,04 % розчину аміака. Фотометрія проти 541 мкм на спектрофотометрі проти 0,04 % розчину аміаку. Залишок крові, який не ввійшов у пробірку для інкубації, центрифугують, відділяють сироватку; 0,4 мл сироватки додають до 3,6 мл 0,04 % розчину аміаку. Через добу пробірки струшують.

Після закінчення інкубації із пробірок відсмоктують після центрифугування сироватку і до 0,4 мл її добавляють 3,6 мл 0,04 % розчину аміаку. Обчислюють відсоток гемолізу у кожній пробі за формулою:

(Е 541 СП – Е 541 СД)х10

% гемолізу = Е 541 К

де Е 541 СД – оптична щільність суміші аміаку і сироватки крові до інкубації; Е 541 СП – оптична щільність суміші аміаку і сироватки крові після інкубації; Е 541 К – оптична щільність суміші крові з аміаком.

У здорової людини через 48 годин гемолізується 0,05 - 2,5 % еритроцитів. У флаконах, в які додається глюкоза і АТФ, відсоток гемолізу ще нижче (1,5 %).

Визначення осмотичної резистентності еритроцитів (за Дасіе)

Визначення осмотичної резистентності можна проводити у свіжих еритроцитах і в еритроцитах, інкубованих протягом доби при 37^оС у стерильних умовах.

Апаратура: фотоколориметр; термостат на 37^оС .

Реактиви: основний розчин, відповідаючи осмотичності 10% розчину NаС1 (Nа₂НPО₄ – 27,31г; NаН₂PO₄ - 4,86 г, NаСІ – 180 г).

Всі реактиви розчиняють у 2 л води; рН цього розчину має бути 7,4. Розчин може зберігатися у закритому посуді у холодильнику протягом кількох місяців. Із нього готують 1 % розчин. Із останнього розчину готують всі інші: 0,85%; 0,75%; 0,65%; 0,55%; 0,50%; 0,45%; 0,40%; 0,35%; 0,30%; 0,25%; 0,1%. Можна приготувати одночасно по 100 мл робочих розчинів і зберігати їх на протязі 2 тижнів у холодильнику.

Хід дослідження. У дві стерильні пробірки, що містять по 2 краплі гепарину, наливають по 1,5 мл крові. Одну пробірку ставлять на добу в термостат, другу - використовують у день забору крові. 1% розчин хлористого натрію і всі робочі розчини розливають у центрифужні пробірки по 5 мл. До кожної пробірки піпеткою від гемометра додають не перемішану кров у кількості 0,02 мл. Пробірки залишають стояти при кімнатній температурі ЗО хвилин, потім центрифугують при 2000 оборотах на хви­лину протягом 5 хвилин. Зливають верхній шар з кожної пробірки і фотометрують на фотоколориметрі при зеленому світлофільтрі у кюветі із довжиною оптичного шляху 1 см проти надосадового шару пробірки, що вміщує 1% розчин повареної солі. За 100% гемоліз приймають оптичну щільність у надосадовому шарі пробірки, яка містить 1% розчин повареної солі.

Приклад.

У концентрації NаС1 0,1% оптична щільність дорівнює 0,650, 0,4% - 0,220.

0,650 - 100% гемоліз

0,220 – х х=34%

Другу пробірку, вміщену у термостат, достають через 24 години і дослід повторюють. Дані про нор­мальну осмотичну резистентність еритроцитів:

Концентрація NaCl	% гемолізу
	у свіжій крові	інкубованій на протязі доби
0,20	98 - 100	95 – 100
0,30	97 - 100	85 – 100
0,35	90 - 100	75 – 100
0,40	50 - 100	65 – 100
0,45	5 - 45	55 – 95
0,50	0 - 6	40 – 85
0,55	0	15 – 70
0,60	0	0 – 40
0,65	0	0 – 10
0,70	0	0 – 5
0,75	0	0
0,80	0	0
0,85	0	0

Діагностичне значення. При мікросфероцитарній гемолітичній анемії спостерігається зниження осмотичної резистентності еритроцитів. Вже у концентрації NаС1 0,70 - 0,65% маємо гемоліз. У деяких хворих на мікросфероцитоз виявити зниження осмотичної резистентності свіжої крові не вдається, однак в інкубованій крові осмо­тична резистентність різко знижується. Гемоліз може початися у концентрації солі 0,85%.

При таласеміі, а також при деяких видах несфероцитарної гемолітичної анемії відмічається підви­щення осмотичної резистентності еритроцитів. Гемоліз може початися у концентраціях солі 0,35 або 0,30%.

Визначення осмотичної резистентності еритроцитів необхідно проводити у всіх випадках, коли ма­ємо внутрішньоклітинний гемоліз. Бажано досліджувати осмотичну резистентність не тільки свіжої, але й інкубованої крові протягом доби.

Визначення механічної резистентності еритроцитів

Визначення механічної резистентності еритроцитів має важливе значення для диференційної діагностики залізодефіцитної анемії та набутих гемолітичних анемій. Використовують метод Шина-Кастла-Флемінга та Мамонта-Біанкі. Він полягає в механічному травмуванні еритроцитів до їх руйнування та виділення гемоглобіну в плазму. Для забезпечення метода необхідний спеціальний апарат для струшування. Для забезпечення досліду використовують 0,85% розчин хлоріду натрію.

Хід дослідження. 20,0 мл венозної крові дефібринують, виливають у спеціальний стаканчик і вставляють в апарат-струшувач. Струшування здійснюють 30 хвилин при 120 коливаннях за 1 хвилину. Потім пробірку з кров’ю центрифугують. Збирають надосадовий шар плазми і колориметричним методом досліджують кількість вільного гемоглобіну. В нормі вміст вільного гемоглобіну сягає 1,5 -3,5%. Метод Мамонта-Біанкі полягає в неповному руйнуванні еритроцитів до окремих фрагментів-уламків.

Реактиви: 2,8% розчин натрію цитрату; 0,5% розчин желатину; розчин Зінгера-Локка.

Хід дослідження. Кров об’ємом 1,0 мл, стабілізовану сумішшю реактивів (по 2,0 мл кожного) центрифугують 5 хвилин при 500 об./хв. Фрагменти еритроцитів, що утворюються при цьому, спливають у шар плазми. Плазму відбирають у чисту пробірку, а кров знову центрифугують 5 хвилин при 500 об./хв. Із отриманого після останнього центрифугування осаду, який містить фрагменти еритроцитів, готують мазки та нативні препарати. При мікроскопічному дослідженні серед цілих еритроцитів знаходять різні фрагменти різної величини і форми. Для кількісної оцінки ступеню руйнування еритроцитів підраховують кількість фрагментів відносно 1000 еритроцитів у фарбованих за Паппенгеймом мазках. У здорових людей фрагментація еритроцитів незначна і становить 0,75 - 3%. Перевищення цього показника слід вважати патологією.

Клінічне значення. Механічна резистентність еритроцитів знижується у хворих на гіпер- та гіпохромні анемії. Зниження її при цих анеміях, як правило, поєднується з підвищеною осмотичною резистентністю. У хворих із спадковим мікросфероцитозом руйнування еритроцитів на фрагменти не спостерігається.

Визначення вільного гемоглобіну плазми (метод Бінга в модифікації Дервіза і Бялко)

Метод заснований на здатності гемоглобіну вступати в реакцію з бензидином у малому середовищі у присутності перекису водню з утворенням зеленого забарвлення, що переходить спочатку у синє, а потім у червонувато-фіолетове. Інтенсивність кольору пропорційна кількості гемоглобіну.

Апаратура: фотоколориметр або спектрофотометр.

Реактиви: 1. Ацетатний буфер рН 4,6; 0,1 м. 27,22 г ацетату натрію (СН_ЗСООNа х 8 Н₂О) розчинюють в 1 л води (0,2 М розчин). В іншій мірній колбі готують 1 л 0,2 М розчину оцтової кислоти. Змішують 480 мл розчину 1 та 520 мл розчину 2.

2. Перекис водню 0,3% розчин. Готують перед використанням розведенням пергідролю у 100 разів.

3. Бензидин солянокислий 0,1% розчин: 50 мг солянокислого бензидину розчиняють у 35 - 40 мл аце­татного буферу. Нагрівають розчин до 80^оС на водяній бані. Після охолодження доводять ацетатним буфером до 50 мл. Фільтрують у темну склянку і зберігають при кімнатній температурі не більше тижня. Коли розчин жовтіє, він стає непридатним. Якщо реактив швидко темніє, необхідно перекристалізувати бензидин зі спиртом.

Хід дослідження. Кров для аналізу беруть із вени сухою голкою у силіконіровану пробірку, в якій знаходиться будь-який антикоагулянт. Пробірку центрифугують не більше 10 хвилин при 1500 об/хв. Після відокремлення плазми її знову центрифугують 10 хвилин при 8000 об./хв. для осадження лейкоцитів.

У пробірку наливають 4 мл ацетатною буфера, 2 мл перекису водню, 2 мл бензидину і 0,04 мл досліджуваної плазми. Змішують і залишають стояти протягом 3 хвилини, а потім переливають у кювету з довжиною оптичного шляху 1 см і фотометрують проти компенсаційного розчину при зеленому світлофільтрі. Інтенсивність голубого кольору наростає протягом 4 - 5 хвилин, тому вимірюють 3 - 5 разів підряд і реєструють максимальні показники. Через 5 - 6 хвилин колір набуває фіолетово-бурий відтінок і величина оптичної щіль­ності починає знижуватися. Результат беруть середній із визначення максимальної щільності 2 проб.

Компенсаційний розчин, що складається з 6 мл ацетатного буферу, 8 мл перекису водню, 3 мл розчину бензидину і 0,06 мл фізіологічного розчину, готують одночасно з пробою. Калібровану криву виводять за розчином гемоглобіну. У будь-якій крові, відібраній для приготування розчину гемоглобіну, вимірюють вміст гемоглобіну (на фотоколориметрі або спектрофотометрі). Готують розчин гемоглобіну (І г/л). З нього готують розчини меншої концентрації: 0,005 г/л; 0,025 г/л; 0,05 г/л; 0,1 г/л; 0,2 г/л. З кожної концентрації додають 0,04 мл до суміші 4 мл ацетатного буфера, 2 мл розчину бензидину та 2 мл розчину перекису водню. Основний розчин гемолізату (1 г/л) для каліброваної кривої має зберігатися на холоді, а робочі розчини слід готувати зразу перед дослідженням.

У нормі у 1 л плазми вміст гемоглобіну 0,01 - 0,04 г/л.

Визначення гемосидеріну сечі

При розпаді гемоглобіну залізо його абсорбується епітелієм ниркових канальців і входить до складу гемосидеріну. Злущений епітелій ниркових канальців у таких випадках має вміст кристалів гемосидеріну. При уважному огляді осадку сечі після центрифугування кристали з гемосидеріну видно і без спеці­ального зафарбування. Однак вони виділяються більш чіткими при зафарбуванні за методом Перльса: після центрифугування сечі верхній шар відсмоктують, до осадку додають свіжо виготовлений розчин 1% жовтої кров'яної солі і 1% розчин соляної кислоти (змішують рівні об'єми 2% НСІ та жовтої кров’яної солі) після перемішування через 10 хв. пробірку центрифугують і осадок продивляються. Гемосидерін виявляється у вигляді кристалів синього кольору.

Проба Хема

Проба запропонована для діагностики пароксизмальної нічної гемоглобінурії (хвороба Маркіафави-Мікелі). Заснована на знижені стійкості еритроцитів цих хворих до зниження рН у присутності компліменту свіжої сироватки.

Апаратура. Фотоелектроколориметр або спектрофотометр, водяна баня із температурою 37 та 56 градусів.

Реактиви. 0,2 М розчин соляної кислоти; 0,04% розчин аміаку.

Хід дослідження. З вени набирають 5 - 6 мл крові. Як антикоагулянт можна застосувати гепарин, щавлевокислий або лимоннокислий натрій. Одночасно беруть 15 - 20 мл крові у донора тієї ж групи. Відділяють еритроцити від плазми у хворого і донора. Сироватку донора розливають по 0,5 мл у 6 пробірок. Дві з них поміщають на 20 хв. у водяну баню з температурою 56 градусів для інактивації компліменту сироватки, інші залишають при кімнатній темпе­ратурі. Еритроцити хворого двічі промивають фізіологічним розчином і потім суспензують у фізіологіч­ному розчині у співвідношенні 1:1.

Виготовлення інкубаційної суміші для дослідження чутливості еритроцитів до компліменту у пробі Хема.

Найменування реактивів і матеріалів	Кількість реактивів і матеріалів, мл
	Досліджувана проба Контроль
	Номер пробірки
	1	2	3	4	5	6
Сироватка здорової людини	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0
Неактивована сироватка	0	0	0,5	0	0	0,5
0,2 М розчин соляної кислоти	0	0,05	0,05	0	0,05	0,05
50% суспензія еритроцитів хворого	0,05	0,05	0,05	0	0	0
50% суспензія еритроцитів донора	0	0	0	0,05	0,05	0,05

Вміст пробірок змішують, пробірки приміщують на 1 годину в повітряну баню при 37 град., після чого центрифугують. Для холостого досліду 0,05 мл еритроцитів хворого і донора додають окремо до 55 мл фізіологічного розчину. Після центрифугування можна на око оцінити характер гемолізу. Для кількісної оцінки ступеню гемолізу в кожній пробірці 0,3 мл поверх нього шару додають до 4,7 мл 0,04% розчину аміаку. В пробірку з холостою пробою до 4,7 мл 0,04% розчину аміаку додають 0,3 мл вихідної сироватки. Для оцінки 100% гемолізу до 4,7 мл розчину аміаку додають 0,3 суспензії еритроцитів (0,05 мл еритроцитів хворого в 0,55 мл фізіологічного розчину).

Фотометрія проти 0,04% розчину аміаку:

Е1-Е2

% гемолізу= Е3- ---X100, де

Е1 - оптична щільність дослідної проби;

Е2 - оптична щільність холостої проби;

ЕЗ - оптична щільність 100% гемолізу.

У нормі гемолізується не більш ніж 5% еритроцитів.

Проба Хема вважається позитивною в тому випадку, якщо гемолізується більш ніж 6% еритроцитів. При пароксизмальній нічній гемоглобінуріі і гемолізованій формі аутоімунної гемолітичної анемії гемолізується іноді 50 - 80% еритроцитів. Для цих хвороб характерний гемоліз лише у присутності не інактивованої сироватки (пробірка N 2). Якщо інактивація сироватки не запобігає гемолізу (пробірка N 3) можна думати, що мова йдеться про іншу форму гемолітичноі анемії або про помилку у постановці дослідження.

Еритроцити хворих із пароксизмальною нічною гемоглобінурією самі по собі не руйнуються при рН 6,5. Потрібна обов'язкова присутність у середовищі компліменту, що знаходиться у свіжій сироватці.

Цукорозна проба (Harts I Jenkins у модифікації Л. І. Ідельсона)

Еритроцити хворих пароксизмальною нічною гемоглобінурією і гемолізиновою формою аутоімунної гемолітичної анемії руйнуються у розчинах з низькою іонною силою у присутності компліменту.

Апаратура. Спектрофотометр або фотоколориметр. Водяна баня на 56 градусів для інактивації сироватки.

1) Розчин сахарози: 9,42 г сахарози розчиняють у фосфатному буфері рН 6,2; 0,005 М (91 мл 0,005 М NаН₂РО₄ і 9 мл 0,005 М Nа₂НРО₄).

2) Реактив для визначення гемоглобіну: 200 мг червоної кров’яної солі розчиняють у 1 л дистильова­ної води, туди ж додається 0,5 мл ацетонциангідрину.

Хід дослідження. Кров у хворого беруть із вени у дві пробірки - у суху і з антикоагулянтом. Як антикоагулянт можна використати тільки лимоннокислий натрій. Еритроцити двічі із пробірки з антикоагулянтом відмивають фізіологічним розчином. Після відмивання і відсмоктування непосадочної рідини до 0,4 мл еритроцитів додають 0,25 мл фізіологічного розчину. Одночасно беруть кров у донора тієї ж групи крові у дві пробірки - з антикоагулянтом 2 - 3 мл (цю пробірку обробляють так, як і пробірку з еритроцитами хворого) і в суху 8 - 10 мл для одержання сироватки. Після відділення донорської сироватки 0,5 мл її поміщають у водяну баню при температурі 56 градусів на 30 хвилин для інактивації компліменту. Сироватка донора повинна бути взята у день досліду і зберігати її слід на холоді.

Схема постановки досліду

Найменування реактивів і матеріалів	Кількість реактивів і матеріалів, мл
	Номер пробірки
	1	2	3	4	5	6	7	8
Розчин сахарози	0,8	0,8	0,8	0,8	0,8	0,8	-	-
Суспензія еритроцитів хворого	0,1	-	0,1	0,1	-	0,1	0,1	-
Суспензія еритроцитів донора	-	0,1	-	-	0,1	-	0,1	0,1
Сироватка донора неактивована	-	-	-	0,1	-	-	-	-
Сироватка хворого	-	-	0,1	-	-	-	-	0,1
Дистильована вода	-	-	-	-		-	0,8	0,8
Фізіологічний розчин	-	-	-	-	-	-	0,1	-

Пробірки розташовують у термостаті при температурі 37 градусів на 30 хвилин, а потім центрифугують зі швидкістю 3000 об./хв. на протязі 10 хвилин.

Дня кількісної оцінки ступеню гемолізу у пробірки розливають по 3,4 мл реактиву для визначення гемоглобіну (2) та 0,6 мл неосаджуваного шару із кожної пробірки. Через 10 хвилин пробірки фотометрують при 540 нм на спектрофотометрі або фотоколориметрі при зеленому світлофільтрі проти розчину для визначення гемоглобіну. Береться середнє із двох показників кожного досліду. Розрахунок проводиться по формулі:

Е1 - Е5

Процент гемолізу у пробірці 1 = —-—-—х 100, де

Е8 - Е5

Е1 - оптична щільність розчину у пробірці N 1;

Е5 - оптична щільність розчину у пробірці N 5, що необхідно для виключення кольору самої сироватки;

Е8 - оптична щільність розчину у пробірці N 8, де пройшов повний 100% гемоліз.

Для перехресної цукорозної проби (пробірка N 2) 100% гемоліз досліджується у пробірці N 7.

Оцінка результатів. У нормі у пробірці N 1, із еритроцитами досліджуваного хворого, гемоліз не завищує 2 - 3 %. При пароксизмальній нічній гемоглобінуріі (хвороба Маркіафави-Мікелі) і гемолізованій формі аутоімунної гемолітичної анемії (АІГА) у цій пробірці гемоліз перевищує 6%. У контрольних пробірках (пробірка N 4, що з еритроцитами хворого і неактивованою сироваткою донора; пробірка N 5, у якій еритроцити і сироватка донора; пробірка N 6, у якій замість сироватки фізіологічний розчин, гемоліз не повинен перевищувати 1 - 2%. Перехресна сахарозна проба (пробірка N 2) позитивна при наявності гемолізинів у сироватці при гемолізиновій АІГА. Однак і при гемолізинової форми АІГА вона може бути негативною. У пробірці N 8 (еритроцити хворого і його ж сироватка) гемоліз буває як при хворобі Маркіафави Мікелі, так і при гемо­лізованій формі АІГА. При хворобі Маркіафави-Мікелі найбільший гемоліз зустрічається у звичайній сахарозній пробі (пробірка N 1), менший - у пробі із власними еритроцитами (пробірка N 3) і негативний результат - у перехресній сахарозній пробі (пробірка N 2). При гемолізованій формі АІГА найбільший ре­зультат виявляється у пробі з своєю сироваткою і своїми еритроцитами хворого (пробірка N 3), дещо мен­ший гемолізу пробірці N1. У пробірці N 2 часто буває гемоліз, але відсутність його не виключає гемолізинову форму АІГА.

Агрегат - гемаглютінаційна проба

Перший етап реакції - це звичайна антиглобулінова пряма проба Кумбса з антисивороткою кролика проти гамма-глобуліна людини. В разі негативної проби еритроцити відмивають від не зв’язаних антитіл і потім до них добавляють тест-еритроцити з агрегатованою на них антисироваткою, отриманою від іншої тварини (наприклад, осла або барана), імунізованого гамма-глобуліном кролика.

ДОДАТОК 2. Методи дослідження гемостазу.

Методи дослідження судинно-тромбоцитарного гемостазу

Визначення резистентності (ламкості) мікросудин

(Манжеточна проба М.П. Кончаловського, Румпель-Лееде)

Створюють венозний стаз шляхом дозованого стиску плеча манжетою від апарата для виміру АТ й підраховують кількість петехій, що утворилися у верхній частині долонної поверхні передпліччя й ліктьового згину. Якщо кількість петехій перевищує норму, то це говорить про зниження резистентності (підвищену ламкість) мікросудин.

Хід дослідження (варіант Borchgrevink, 1971). На верхній частині долонної поверхні передпліччя окреслюють коло діаметром 5 см. На плече накладають манжету від апарата для виміру АТ, з'єднують її з манометром і підтримують протягом 5 хв. тиск на рівні 90 мм рт. ст. Потім манжету знімають і протягом 5 хв. чекають відновлення кровообігу в кінцівці. Після цього підраховують кількість петехій в обкресленому колі. Ураховують і появу геморагій уздовж нижнього краю манжети, які в нормі відсутні.

Читання результатів.

У нормі кількість петехій у жінок не перевищує 10, при 11 - 20 петехіях проба вважається слабко позитивною, при 20 - 30 петехіях - позитивною, при 30 і більше - різко позитивною. У чоловіків петехії в нормі не виникають. Можливі причини позитивної проби: тромбоцитопенія, тромбоцитопатії, гіповітаміноз С, хвороба Віллебранда, прийом антикоагулянтів, гормональні зрушення в жінок.

Визначення часу кровотечі (за Дьюком)

Визначається тривалість кровотечі з мікросудин шкіри, після дозованого її проколу звичайним плоским ланцетом або спеціальним скарифікатором з обмежником глибини (3,5 мм).

Хід визначення. Мочку вуха зігрівають між пальцями протягом 1 хв., протирають спиртом і знову зігрівають настільною лампою до повного висихання спирту. Стерильним ланцетом роблять прокол шкіри в нижньонаружному краю мочки вуха глибиною в 3,5 мм. Відразу ж після проколу включають секундомір, розтягують краю ранки не торкаючись неї. Виступаючі краплі крові промокають через кожні 15 - 30 с фільтрувальним папером, не доторкаючись їм до ранки. Секундомір зупиняють у момент припинення витікання крові (мокнуття не враховується). Для більшої точності тест виконується двічі на обох мочках вух.

Читання результатів.Нормальний час кровотечі не перевищує 4 хв. Перші плями крові на папері малі (спазм судин), потім вони збільшуються, досягаючи максимуму на 1 - 2 хв. після чого зменшуються й зникають. При різко вираженій тромбоцитопенії й важких формах якісної неповноцінності тромбоцитів (тромбастенія Гланцмана та ін.) і, особливо, при хворобі Виллебранда, час кровотечі різко подовжується. Плями крові досягають дуже великих розмірів, довгий час не зменшуються, або хвилеподібно то зменшуються, то спонтанно збільшуються. При гемофіліях час кровотечі залишається нормальним або подовжується лише злегка, оскільки зупинка кровотеч у зоні мікроциркуляції забезпечується, в основному, тромбоцитами, а не згортанням крові. Але при дефіциті факторів протромбінового комплексу, лікуванні антикоагулянтами й ДВЗ-синдромі час кровотечі подовжується.

Варто враховувати, що метод Дьюка недостатньо чутливий і нерідко дає помилкові результати (через раннє склеювання країв ранки й інших причин). При багатьох тромбоцитопатіях його показання не порушуються. Тому в цей час частіше користуються більше чутливими методами Айві або Борхгревинка-Ваалера.

Визначення часу кровотечі (за А. Д. Айві та співавт.)

Визначається тривалість кровотечі із капілярів і венул шкіри, цілісність яких порушується строго до­зовано за допомогою плоского ланцету.

Хід дослідження. На плече накладають манжет сфігмоманометра та на протязі всього дослідження підтримують у ній тиск 40 мм. рт. ст. На обробленій спиртом долонній поверхні верхньої третини передпліччя натягують шкіру і наносять ланцетом три поперечні проколи глибиною у 3 мм. Негайно вмикають секундомір. Краплі крові, що з'являються з ранок, промокають фільтрувальним папером (не доторкуючись до ранки) через кожні 15 або 30 секунд. Реєструють час припинення кровотечі із кожної ранки. Результати відмічають окремо і ли­ше при дуже близькому збігові часу кровотечі з усіх трьох ранок можна обчислювати середню величину цього показника.

Читання результатів. Нормальний час кровотечі по Айві звичайно не перевищує 8 хвилин. При різко виражених тромбоци­топеніях і тяжких формах якісної неповноцінності тромбоцитів (особливо при хворобі Віллебранда) час кровотечі різко подовжується. При деяких коагуляційних порушеннях (тяжких тромбогеморагічних синд­ромах, значній гіпергепаринеміі) час кровотечі також подовжується.

Метод А.С. Шитікової (1975)

Принципово той же, що і метод за Айві, але прокол шкіри робиться в область кінцевої фаланги пальця. Враховують не тільки час кровотечі, але й обсяг крові, яка витекла (для цього палець занурюють в стакан з визначеним обсягом води, а потім фотометрують її, визначаючи ступінь забарвлення води кров’ю).

Хід визначення. В дві пластикові бакпечатки разового користування вносять по 5 мл. стерильного фізіологічного (0,9%) розчину хлориду натрію. На плече накладають манжету сфігно-манометра та підтримують в ній тиск ( на протязі всього часу дослідження) 40 мм рт. ст. Обробляють спиртом кінцеву фалангу III або IV пальця, роблять укол скарифікатором в подушечку кінцевої фаланги на глибину 3,5 мм та тимчасово включають секундомір. Кінчик пальця, який укололи, розміщують в верхній частині фізіологічного розчину, спостерігають за кров’ю, яка витікає та в момент повного припинення кровотечі виключають секундомір. Вимірювання проводять двічі, враховуючи найбільшу величину кровотечі. В нормі кровотеча не більше 3,5 хвилин ( у чоловіків – 70-196 с., у жінок - 87-208 с.).

Апаратні методи

В зв’язку з тим, що визначення часу стандартизовано та виявляє лише найбільш значні порушення мікроциркуляторного гемостазу, запропонований ряд приладів для врахування цього параметру in vitro. Частіше за інші для цього використовується фільтрометр PFt-ЮО фірми Dade Behring, в якому реєструється швидкість блокади мікро фільтра агрегатами тромбоцитів при стандартизованому пропуску через нього досліджуваної крові. Прилад дорогий, тому поки що рідко використовується діагностичними лабораторіями.

Підрахунок кількості тромбоцитів

Підрахунок у камері (Баркаган З.С., 1988)

Метод заснований на підрахунку тромбоцитів у 1 мкл крові при постійному розведенні і визначеному об’ємі лічильної камери із використанням фазово-контрастного приладу.

Апаратура. 1. Мікроскоп. 2. Фазово-контрасний прилад (КФ). 3. Лампа освітлювальна до мікроскопу (ОІ-7,01-8). 4. Камера Горяєва.

Реактиви. 1. 3 г кокаїну гідрохлориду, 0,25 г хлориду натрію, 0,025 г фураціліну розводять у 100 мл дистильованої води; або

2. 2,1% розчин оксалату амонію. Розчин кип'ятять та фільтрують. Зберігають у холодильнику. Одержання фазового ефекту - згідно з інструкцією, яка додається до фазово-контрасного приладу.

Хід дослідження 0,02 мл крові поміщують у пробірку з 4 мл розчину 1 або 2. Залишають на 25 - 30 хв. для гемолізу еритроцитів. Після повторного перемішування заповнюють камеру Горяєва, яку поміщають у вологу каме­ру. За 5 хвилин підраховують кількість тромбоцитів у 25 великих квадратах.

Розрахунок. Кількість тромбоцитів у 1 мкл крові визначають за формулою:

А х 4000 х 200

X = ---------------------- , де

400

А - кількість тромбоцитів, підрахованих у 400 маленьких квадратах;

200 - розведення крові;

4000 – число, яке приводить результат до об'єму 1 мкл, виходячи з об’єму маленького квадрату;

400 – число перелічених маленьких квадратів.

Число тромбоцитів у 400 маленьких квадратах перемножують на 2000.

Мікроскопічний метод підрахунку (Баркаган З.С., 2001)

В даний час все ширше використовується визначення кількості тромбоцитів та їх розподіл за величиною (гістограма) за допомогою автоматичних лічильників крові. Ці апарати являються точними та дозволяють проводити експрес-діагностику (визначення виконуються за 1 хвилину).

Принцип. Виконується підрахунок тромбоцитів в камері Горяєва, при цьому

використовують в якості розчинної та гемолізуючої рідини розчин оксалату амонію. При підрахунку використовують фазово контрастну мікроскопію.

Реактиви. 1% розчин оксалату амонію.

Хід визначення. Дослідження можна проводити як в крові, яку взяли із пальця, так і в стабілізованій цитратом венозній крові. В останньому випадку отриманий при підрахунку результат перемножують на коефіцієнт 1,1 (враховують розведення венозної крові розчином цитрату натрію -9:1).

Розведення крові. Найбільш зручним та достатньо точним являєтся спосіб разведення крові в пробірках (не в меланжері). Для цього, в попередньо висушену чисту силиконову чи пластикову (полістирол) пробірку піпеткою відміряють 1,98 мл 1% оксалату амонію та обережно вносять в неї 0,02 мл крові. На протязі 1-2 хвилин уміст пробірки ретельно перемішують без утворення піни. Заповнюють дві камери Горяєва и на 10-15 хвилин розміщують їх для осідання тромбоцитів в вологу камеру (чашку Петрі зі змоченою фільтрувальною бумагою або марлею). В кожній камері рахують тромбоцити в 25 великих квадратах..

Фазовоконтрастна мікроскопія проводиться за допомогою звичайного

мікроскопа, освітлювача типу ОІ-19 (або аналогічного) та обладнання для спостереження методом фазового контрасту КФ-1 або КФ-4.^

Підготовка мікроскопа. Після установки в мікроскопі фазових об’єктивів та фазового конденсора виконують фокусировку об’єктивів 40х на сітці камери Горяєва. Установлюють освітлення та центрують зображення фазової пластинки та кільцевої діафрагми. Микроскопію проводять із зеленим світлофільтром. При роботі з фазовоконтрастною установкою необхідно користуватися камерами одного типу, тому що фокусировка оптичних систем залежить відт товщини скла камери.

Розрахунок визначення числа тромбоцитів в 1 мкл крові. Середню арифметичну величину із двох паралельних визначень перемножують на 1000 (площа 25 великих квадратів - 1 мм², висота камери - 0,1 мм, розведенння 1:100; тобто, кількість тромбоцитів повинна бути помножена на 1x10x100 = 1000).

Нормальні межі коливань числа тромбоцитів в крові у людини складають від 170 до 350 х 10⁹/л. Помилка методу + 6,5%.

Підрахунок тромбоцитів у крові та визначення їх розміру у мазку - важлива частина діагностики тромбоцитопеній, есенціальної та поліцитемічної тромбоцитемії, ДВС-синдрома, тромботичної тромбоцитопенічної пурпури та інших мікротромбоваскулитів, порушень гемостазу при аутоімунних формах патології (СКВ, антифосфоліпідний синдром та інше) та при гепатолієнальному син­дромі. При спадкоємних тромбоцитопатіях спостерігаються фор­ми з мікроцитозом (синдром Віскотта-Олдрича) та перевагою гігантських форм кров’яних пластинок (аномалії Бернара-Сул’є та Мей-Хегглина), а також форми без змін розмірів цих клі­тинних елементів.

Визначення кількості та розміру тромбоцитів за допомогою автоматичних лічильників крові

Для цих досліджень придатні будь-які автоматичні лічильники крові - від найпростіших 9 - 18-параметрових до высоко технологіч­них.

В лабораторіях авторів високу інформативність и точність показали лічильники фірми Hoffmann - La Roche, Abbott, Highsell. У всіх випадках кров стабілізується в пластикових пробірках за допомогою ЕДТА (трилона Б).

Дослідження адгезивності тромбоцитів (метод Мультену і Врамену)

Визначення грунтується на різниці кількості тромбоцитів до і після фільтрації через скляну вату.

Апаратура. 1. Силіконірований посуд (дивись нижче). 2. Скляна вата (або скловолокно).

Реактиви. 1. Стабілізатор: 3 г глюкози, 3 г цитрату натрію розчиняють у 100 мл дистильованої води. 2. 3,8% розчин цитрату натрію. 3. Фізіологічний розчин.

Хід дослідження. Попередньо готують із прокип'яченої кілька разів скляної вати фільтр у вигляді косичок розміром 1 х 5 см. Кожну косичку поміщають у силіконіровану воронку, вставлену у силіконіровану колбочку. Фільтр змочують у 1,5 мл фізіологічного розчину і поміщують у термостат при 37 градусах. Кров із стабілізатором набирають у пробірки (дивись "Підрахунок еритроцитів") і рахують у камері Горяєва еритроцити та тромбоцити. Силіконірованою піпеткою беруть 1 мл крові і ф1льтрують по краплинам через нагрітий до 37 гра­дусів фільтр, зроблений із скляної вати. Через 30 сек. фільтр промивають 8 мл рідини (1 мл 3,8% розчину цитрату натрію і 9 мл фізіологічного розчину). Воронку знімають, фільтрат перемішують, набирають 20 мкл фільтрату піпеткою від гемометра Салі і переносять у пробірку, що вміщує 0,4 мл 3,8% розчину цит­рату натрію. Підраховують число еритроцитів та тромбоцитів. Еритроцити рахують у 5 великих розграфлених квадратах, тромбоцити - у 25 розграфлених квадратах і перемножують на 2. Розрахунок роблять та­ким чином:

Показники До фільтру Після фільтру

Сума еритроцитів у 5 квадратах 372 356

Число тромбоцитів у 25 квадратах, 160 148

перемножене на 2

Загальна кількість еритроцитів із 372x10x10000 356x10x10 000

переліком на розведення 9 9

= 4133 300 =3 955 550

Загальна кількість тромбоцитів 160x10x1000 148x10x1000

із переліком на розведення 9 9

= 177 780 =164440

Кількість еритроцитів, віднесена 4133 300 3 955 550

до загальної кількості тромбоцитів 177 780 164 446

= 23,2 =24,05

24,05

Індекс адгезивності = ------------ = 1,04

23,2

Для підрахунку кількості адгезивних тромбоцитів Мооlten та Vгоman запропонували слідуючу формулу: загальну кількість тромбоцитів перемножують на

1

(1 - ------------------------------------).

індекс адгезивності + 0,3

У наведеному прикладі кількість адгезивних тромбоцитів:

1

177 780 (1------------------) = 71 112.

1,365 + 0,3

У здорових осіб індекс адгезивності дорівнює 1,02 - 1,5; число адгезивних тромбоцитів становить

41026 - 112 548 у 1 мкл, або 23 - 44%.

Дослідження агрегації тромбоцитів

Принцип. Досліджується процес агрегації в багатій тромбоцитами плазмі з додаванням або без додавання індукторів агрегації. Як індуктори агрегації використовуються АДФ, адреналін, колаген, тромбін, ристоміцин, арахидонова кислота й ряд інших агентів.

Класична методика Born заснована на фотометричній реєстрації процесу агрегації по падінню оптичної щільності плазми при дотриманні певного температурного режиму й стандартного перемішування. Використовуються різні варіанти спеціальних приладів - агрегометрів, для плазми, з'єднані з комп'ютером і принтером. В останні роки знайшли також застосування агрегометри, засновані на кондуктометричному і інших принципах реєстрації процесу склеювання тромбоцитів між собою, придатні для дослідження цільної крові.

Спонтанна агрегація тромбоцитів

Існуюча методика визначення спонтанної агрегації за Wu et Hoak (1974) вимагає проведення негайної обробки крові при її заборі, що створює певні труднощі в її виконанні. Далі приводиться простий спосіб кількісної оцінки спонтанної агрегації тромбоцитів крові, стабілізованої цитратом натрію в умовах турбулентності.

Хід дослідження. Для взяття крові і її обробок використовуються силіконіровані або пластикові (полістирол) пробірки й піпетки. Дослідження стабілізованої крові проводиться не пізніше, ніж через 90 хв. після забору крові. Для видалення агрегатів використовується відстоювання.

Оцінка результатів Спонтанна агрегація оцінюється за різницєю в числі тромбоцитів у надосадовій частині стабілізованої крові після її струшування й наступної фіксації агрегатів тромбоцитів розчином формаліну в порівнянні з такою ж кров'ю без струшування й фіксації.

Реактиви. 1,1 % розчин формаліну у фізіологічному (0,9%) розчині хлориду натрію, 2,1 % розчин оксалату амонію.

Матеріал для дослідження. Цитратна венозна кров.

Хід визначення. У кожну з 2 чистих пробірок вносять по 0,5 мл крові, одна з пробірок струшується (на струшувателі АВУ-1, шейкере S-3 або ін.) із частотою 90-100 разів у хв. протягом 3 хв. Потім у цю пробірку додають 1,0 мл 1% розчину формаліну на фізіологічному розчині для фіксації агрегатів. В іншу пробірку до 0,5 мл крові додають 1,0 мл фізіологічного розчину хлориду натрію, все ретельно перемішують і після 30-хвилинного відстоювання підраховується кількість залишених в супернатанте й не осілих у вигляді агрегатів тромбоцитів.

Для підрахунку кількості тромбоцитів змішують 1,98 мл 1% оксалату амонію й 0,02 мл супернатанта, добре перемішують без піни й підраховують кількість тромбоцитів при фазовому контрасті у двох камерах Горяєва (після відстоювання внесеної в них розведеної крові протягом 15-20 хв) у 25 великих квадратах. Розрахунок спонтанної агрегації тромбоцитів проводять по формулі:

А-В х 100,

А

де А - кількість тромбоцитів у крові без струшування, В - кількість тромбоцитів у крові після струшування.

Читання результатів. У нормі спонтанна агрегація тромбоцитів у середньому становить 12,1±1,4% і не перевищує 20%. Помилка методу рівняється ± 8%, при збільшенні числа рахованих квадратів з 50 до 100 остання знижується до ± 3%.

Значне підвищення спонтанної агрегації (більше 20%) спостерігається у хворих з схильністю до тромбозів і інфарктів органів, при облітеруючих захворюваннях артерій, ІХС, тромбоемболіях, пов'язаних з гіперагрегацією тромбоцитів, при тромбофіліях і при більшості форм ДВЗ-синдрому, а також при тромботичній тромбоцитопенічній пурпурі, гемолітико-уремічному синдромі, мікроангіопатіях та інших видах схильності до тромбозів.

Визначення агрегації тромбоцитів (для лабораторій, які не мають агрегометрів)

На годинниковому склі до 0,45 мл РRР (багата тромбоцитами плазма) додається 0,05 мл розчину ристоміцину. Разом з цим починається відлік часу. Відмічається час при появі видимих агрегатів. Для першого дослідження є достатнім використання розчину ристоміцину концентрацією в 12 - 15 мг/мл, у сумнівних ви­падках доцільне виготовлення повного ряду розчинів. Дослідження в усіх випадках слід починати конт­рольною РRР та розчином ристоміцину найбільшого розведення. Необхідно проводити два паралельні дос­лідження. Для реакції є достатньою кімнатна температура. При різниці у 5 - 10 сек. результат сумнівний.

Дослідження агрегації тромбоцитів за допомогою АДФ

Подібно ристоміцин-тесту на годинникове скло до 0,45 мл РRР додається 0,05 мл розчину АДФ, разом з цим починається відлік часу. Реєструється час появи видимих агрегатів ("симптом снігового вихру"). Дослідження проводиться на темному фоні при кімнатній температурі. Рекомендована концентрація роз­чину АДФ - 2,5 мг/мл. Після додання розчину АДФ обережними нахилами годинникового скла забезпечу­ється змішування розчинів. Проводять два паралельні досліди, тест завжди починається з контрольної РRР. При нормальних умовах добре видимі агрегати з'являються на протязі 20 - 25 секунд. У разі тромбастеніі, атромбіі агрегати взагалі не з'являються. У разі порушень вторинної агрегації (тромбопатіі, порушен­ня реакцій звільнення, дія ліків) поява агрегатів запізнюється на 5 - 10 секунд відносно контролю. Тест у цих випадках має лише приблизно інформативне значення.

Дослідження адреналінової агрегаціі

При кімнатній температурі на годинниковому склі до 0,45 мл РRР додається 0,05 мл розчину адреналіну, одночасно з цим починається відлік часу. Реєструється час появи макроагрегатів. При цьому є важ­ливим темний фон, обережне змішування та проведення двох паралельних тестів. Рекомендована кон­центрація адреналіну - 1 мг/мл. У нормальних умовах добре видимі агрегати з'являються на протязі 40 - 50 секунд. У випадках тромбастеніі та есенціальної атромбіі агрегати не створюються. У випадках порушення вторинної агрегації поява агрегатів запізнюється на 5 - 10 секунд.

Дослідження агрегаційної функції тромбоцитів може про­водитися візуально, що при достатньому тренуванні дає орієнтовну інформацію, а також за допомогою спеціальних приладів - агрегометрів. Останні роподіляються на оптичні (турбідиметричні), які реєструють агрегацію в багатій тром­боцитами плазмі за зміною її оптичної щільності, кондуктометричні, які визначають агрегацію в цільній крові по змі­ні електропровідності (метод менш стабільний, дає багато випадкових відхилень) та за допомогою люмі-агрегометрів, які дозволяють реєструвати не тільки процесс агрегації, але й реакцію вивільнення із тромбоцитів АТФ, для чого в середовище вводять люциферин-люциферазний реагент (фірми Sigma обо ін.), який реагує з АТФ. Дослідження виконуються на агрегометрах різних конструкцій (фірм Chrono-log, Helena Laboratories), в тому числі і вітчизняних (фірми Біола, Москва и др.).

Методи дослідження коагуляційного гемостазу обов’язкові тести попередньої діагностики

Визначення часу згортання крові (за методом Lee, White)

Визначають швидкість утворення згустку у венозній крові при температурі +37°С з виправленням на те, що перемішування крові в пробірці штучно прискорює процес коагуляції. Найчастіше використовують двопробірочний варіант тесту, хоча в оригіналі визначення виробляється в 3 пробірках.

Матеріал для дослідження. Кров без стабілізатора.

Хід визначення. Дві чисті й сухі пробірки однакового розміру поміщають на водяну лазню (+37°С). Підготовляють до роботи два секундоміри. Роблять венепункцію широкою сухою голкою, під яку підставляють 1-у пробірку. З появою крові з голки включають секундомір. Набирають в 1-у пробірку близько 1 мл крові, потім підставляють під голку 2-у пробірку, відмічаючи по секундомірі час надходження до неї першої порції крові. В 2-у пробірку набирають ту ж кількість крові, що й в 1-у.

Обидві пробірки негайно поміщають на водяну лазню (+37°С). Після цього через кожні 30 с нахиляють 1-ю пробірку на 60 - 70° до того моменту, поки в ній не відбудеться згортання і кров при нахилі перестане переміщатися в пробірці. При цьому 2-у пробірку залишають нерухливою. Після того як по секундомірі відзначено час згортання крові в 1-й пробірці, починають нахиляти через кожні 30 с 2-у пробірку й реєструють час згортання крові, що перебуває в ній. У момент повного згортання виключають секундомір.

Примітка. У трьохпробірочному тесті після реєстрації згортання в 2-й пробірці по тій же методиці стежать за згортанням крові в пробірці.

Читання результатів. Інтервал часу від моменту запуску секундоміра (від надходження 1-ї порції крові в 1-ю пробірку) до згортання крові в 2-й пробірці характеризує загальний час спонтанного згортання венозної крові при контакті зі склом. В 2-й пробірці кров згортається пізніше, ніж в 1-й, тому що до настання згортання в 1-й пробірці вона залишається нерухливою. При додатку до часу згортання крові в 1-й пробірці додаткового інтервалу, що відбиває запізнювання процесу в 2-й пробірці, вноситься виправлення на турбулентний рух крові. Для більшої точності із загального часу згортання можна відняти різницю в часі між строками надходження крові в 1-у й 2-у пробірки, хоча таке виправлення в більшості випадків не впливає на кінцеві результати дослідження.

Приклад. Час надходження крові в 1-у пробірку (початок відліку часу) - 0 с., в 2-у пробірку - 22 с., час згортання (від початку відліку): в 1-й пробірці - 5 хв. 20 с., у другій пробірці - 8 хв. 40 с. Загальний час згортання - 8 хв. 40 с., а з виправленням на більш пізніше надходження крові в 2-у пробірку: 8 хв. 40 с. - 22 с. = 8 хв. 18с.

У нормі час згортання: в 1-й пробірці – 5 - 10 хв., в 2-й пробірці – 8 - 12 хв. Нормальний підсумовуючий показник – 8 - 12 хв.

Час згортання крові - найпростіший загальний коагуляційний тест, що виявляє у ліжку хворого найбільш грубі порушення в системі згортання крові. Подовження часу згортання може бути пов'язане з вираженим дефіцитом одного або декількох факторів згортання або з надлишком у крові антикоагулянтів (гепарина та ін.). Найбільшою мірою на показаннях тесту відбивається дефіцит факторів, що беруть участь у внутрішньому механізмі утворення протромбінази (факторів XII, XI, IX і VIII), а також фібриногену. Однак дана проба виявляє найбільш важкі форми такої патології, оскільки при рівні VIII, IX і інших факторів вище 4% норми час згортання стає, як правило, нормальним. Тому даний тест не придатний для виявлення легких форм гемофілії та для контролю за достатністю замісної терапії й передопераційної підготовки хворих.

При ДВЗ-синдромі тест виявляє спочатку короткочасну гіперкоагуляцію (негайне згортання крові в голці, або протягом першої хвилини в пробірці), а потім - тривалий період гіпокоагуляції, аж до повного незгортання крові. По точності й відтворюваності цей метод краще інших у своєї групі (у тому числі деяких однопробірочних модифікацій методики Лі й Уайта), але по чутливості набагато уступає сучасним стандартизованим методикам дослідження гемокоагуляції (зокрема АПТЧ або АЧТЧ),

Варіанти методики. 1. Тест може виконуватися й при кімнатній температурі (+18...+25°С), але точність і відображення результатів при цьому набагато знижується. Нормальний час згортання при кімнатній температурі: в 1-й пробірці 5 - 10 хв., загальний час згортання 12 - 16 хв.

2.У літературі зустрічаються рекомендації застосування однопробірочних методів (або паралельно у двох пробірках, але при їхньому одночасному погойдуванні, з обчисленням середньої величині часу згортання), але вони не можуть уважатися модифікацією тесту Лі й Уайта, тому що в них не враховується виправлення на турбу­лентний рух крові. Проте, для експрес-діагностики найбільш важких порушень гемостазу може бути використана й одна з таких методик.

3.Значно менш точні мікрометоди, у яких використовуються невеликі кількості крові (0,1 - 0,2 мл), але вони зручні для застосування в педіатричній практиці й у тих випадках, коли у хворого не вдається одержати достатню кількість крові.

Мікрометод. Визначають час згортання венозної крові при температурі +37°С. Використовують малі кількості крові, виправлення на перемішування крові в пробірці не вносяться.

Хід визначення. Сухою голкою без шприца з ліктьової вени беруть кров у дві сухі скляні пробірки (розміром 10x1 см), у кожну по 0,1 мл. Перші краплі крові випускають на ватяний тампон. Секундомір включають відразу ж при надходженні першої порції крові в пробірку. Пробірки із кров'ю ставлять на водяну лазню (+37°С). Через 2 хв. послу включення секундоміра, а потім через кожні 30 с. пробірки нахиляють на 50 - 60°С. Поки кров не згорнулася, вона розтікається по стінці пробірки, при настанні згортання розтікання крові припиняється. У цей момент виключають секундомір. Час згортання виражають у хвилинах по середньому показнику із двох визначень (в 1-й і 2-й пробірках).

Читання результатів. Нормальний час згортання варіює в межах 5 - 10 хв. При гіпокоагуляції він подовжується, при гіперкоагуляції - коротшає. Тест менш точний, чим класичний метод Лі і Уайта, тому що мала кількість крові контактує з великою площею поверхні скла й не вноситься виправлення на турбулентний рух крові у пробірці. Однак тест може бути використаний для експрес-діагностики найбільш важких порушень згортання у випадках, коли важко одержати досить більші кількості крові. Діагностичне значення тесту таке ж, як і у методах Лі й Уайта.

Макрометод. Принцип той же, що й у попереднього тесту.

Хід визначення. Такий же, як і в попередньому тесті, але в пробірки набирають по 1 мл венозної крові.

Читання результатів. Нормальні показники тесту 4 хв. 55 с. - 11хв. 55 с.

Тлумачення результатів те ж, що й в інших методах дослідження загального часу згортання крові. Тест менш точний, чим класичний метод Лі і Уайта, тому що в ньому не враховується вплив на процес згортання турбулентного руху крові в пробірці при погойдуванні. Виконання тесту при кімнатній температурі ще більше знижує точність і відображення дослідження.

Активований парциальний тромбопластиновий час (АПТЧ) (за Caen та співавт.)

Визначається час зсідання бідної на тромбоцити цитратної плазми при додаванні оптимальної кількості кальцію в стандартизації контактної (каоліном) та фосфоліпідної (еритрофосфатидом) активації процесу зсідання.

Реактиви.1. 0,025 ммоль/л розчину СаС1₂, забуферений (використовується буфер Міхаеліса, pH=7,3). 2. 0,85% NаС1, забуферений.3. Еритрофосфатид-каолінова суміш: у 0,01 % емульсію еритрофосфатиду на забуференому фізіологічному розчині додають сухий каолін із розрахунку 5 мг на 1 мл суміші. Готують щоденно, зберігають на протязі роботи у крижаній бані (4 град.) і постійно струшують для одержання рівномірної суміші. Замість еритрофосфатиду можуть використовуватись кефалін у АПТЧ-реагенті або рослинного походження.

Хід дослідження. Досліджується бідна на тромбоцити цитратна плазма. У пробірку з 0,1 мл досліджуваної плазми додають 0,1 мл еритрофосфатид-каолінової суміші, енергійно струшують та інкубують точно 5 хв. Через 5 хв. додають 0,1 мл попередньо відігрітого до 37 град, розчину СаС1₂, одночасно вмикають секундомір. Відмі­чають час утворення згустку, виймаючи пробірку з бані кожні 3 - 5 сек. і трохи нахиляючи її. Дослідження проводять 2 - 3 рази та беруть середній результат.

Результати та їх тлумачення.

Нормальні показники активованого часткового тромбопластинового часу (АПТЧ) – 35 - 38 сек. АПТЧ подовжується при значному (нижче 25 - 10 %) дефіциті плазмових факторів, окрім фактору VII та фактору XIII, а також при лишку у плазмі антикоагулянтів. Скорочення АПТЧ може вказувати на активацію зсідання крові (підвищення активності плазмових факторів).

Визначення протромбінового часу (за А. Квіком)

Визначається час зсідання рекальціфіцированоі цитратноі плазми при додаванні до неї тромбопластину. Активність тромбопластину тестується на нормальній плазмі.

Реактиви. 3,8% розчин цитрату натрію, м/40 розчин хлориду кальцію, суспензія тромбопластину, активністю в 11 - 15 сек. (тестується на змішаному зразку плазми 5 здорових осіб).

Хід дослідження. Із вени беруть кров, змішують її з розчином цитрату натрію (9:1) та центрифугують на протязі 5 - 7 хв. при 1500 об./хв. 0,1 мл плазми переносять у іншу невелику пробірку та ставлять на водяну баню (37 град). Готують суміш з рівних обсягів розчину хлориду кальцію та суспензії тромбопластину, ставлять пробірку із сумішшю на водяну баню. Через 2 хв. 0,2 мл тромбопластин-кальцієвоі суміші додають у про­бірку з 0,1 мл досліджуваної плазми, негайно вмикають секундомір, змішують вміст пробірки та визнача­ють час зсідання. Для більшої точності проводять два паралельні дослідження (відмінність показників не по­винна перевищувати 1 сек.). Паралельно досліджують еталонну нормальну плазму, складену із різних об'ємів цитратної плазми кількох здорових людей.

Читання результатів. Нормальний протромбіновий час повинен бути 12 - 15 сек.

У віт чизняній практиці протягом тривалого часу використовували розрахунок протромбінового индексу за слідуючою фор­мулою:

ПІ = (ПЧ контрольної нормальної плазми /ПЧ хворого) х 100%.

В нормі він дорівнює (95 – 105%). Подовження протромбінового ча­су при нормальному вмісті у плазмі фібриногену і нормальному тромбіновому часі свідчить про дефіцит одного або кількох факторів протромбінового комплексу (факторів П, V, УІІ та X).

Наведена методика обліку результатів застаріла, не відповідає сучасним вимогам та маскує активність тромбопластина, який використовується. В даний час прийняті слідуючі варіанти оцінки ре­зультатів протромбінового (тромбопластинового) тесту:

Визначають протромбінове відношення (ПВ )за формулою:

ПВ = (ПВ хворого / ПВ контрольної нормальної плазми).

Для різних тромбопластинів ПВ в нормі складає 0,7-1,1.

Далі, для обліку чутливості тромбопластину, зводять ПВ в ступінь МІЧ або ISI (вказана фірмою, яка виготовила, в маркіруванні) і таким чином розраховують міжнародне нор­малізоване відношення (MHВ або INR).

Наприклад, протромбіновий час плазми хворого, який отримує антикоагулянти - 45 с. Протромбіновий час контрольної нор­мальної плазми - 12,7 с. МІЧ (або ISI), указаний в інструкції до тромбопластину -1,1. Звідси MHВ для данного хворого (табл. 14) = ПО^МІЧ = (45 : 12,7)¹'¹ = 3,54¹¹=3,97.

Таблиця 18

Визначення MHВ при чутливості тромбопластина 1,1

ПЧ	MHВ	ПЧ	MHВ	ПЧ	MHВ	ПЧ	| MHВ
0,70	0,68	2,60	2,86	4,50	5,23	6,40	7,71
0,80	0,78	2,70	2,98	4,60	5,36	6,50	7,84
0,90	0,89	2,80	3,10	4,70	5,49	6,60	7,97
1,00	1,00	2,90	3,23	4,80	5,62	6,70	8,10
1,10	1,11	3,00	3,35	4,90	5,74	6,80	8,24
1,20	1,22	3,10	3,47	5,00	5,87	6,90	8,37
1,30	1,33	3,20	3,59	5,10	6,00	7,00	8,50
1,40	1,45	3,30	3,72	5,20	6,13	7,10	8,64
1,50	1,56	3,40	3,84	5,30	6,26	7,20	8,77
1,60	1,68	3,50	3,97	5,40	6,39	7,30	8,91
1,70	1,79	3,60	4,09	5,50	6,52	7,40	9,04
1,80	1,91	3,70	4,22	5,60	6,65	7,50	9,17
1,90	2,03	3,80	4,34	5,70	6,78	7,60	9,31
2,00	2,14	3,90	4,47	5,80	6,91	7,70	9,44
2,10	2,26	4,00	4,59	5,90	7,05	7,80	9,58
2,20	2,38	4,10	4,72	6,00	7,18	7,90	9,71
2,30	2,50	4,20	4,85	6,10	7,31	8,00	9,85
2,40	2,62	4,30	4,98	6,20	7,44
2,50	2,74	4,40	5,10	6,30	7,57

Нормальне MHВ близько до 1,0 і менш як 1,4.

При лікуванні непрямими антикоагулянтами MHВ підтримує на різному рівні, в залежності від клінічної ситуації. Чим вищий показник MHВ, тим значніша отримана гіпокоагуляція і тим частіші та небезпечніші геморагічні ускладнення. Принципово враховувати те, що визначення MHВ, в порівнянні з протромбіновим індексом, дозволяє більш точно підібрати дозу антикоагулянта та зменшити ризик кровотеч, пов’язаних з його пе­редозуванням.

В тих випадках, коли індекс чутливості тромбопластина не відомий, нерідко застосовується розрахунок активності факторів протромбінового комплексу (в відсотках) за Квіком, з використанням калібровочної кривої, побудованої за результатами вимірів ПВ в розведеннях контрольної нормальної плазми (опис методики та калібровочна сітка наводяться в інструкціях до відповідних комерційних наборів для визначення ПВ).

Допустимі межі MHЧ у хворих, які отримують непрямі антикоагулянти

Діапазон MHЧ	Показання для лікування
2,0 - 3,0	Профілактика та лікування венозних тромбозів і тромбоемболії
2,5 - 3,5	Лікування рецидивіруючих та тяжких тромбозів магістральних вен, емболії в бассейні легеневої артерії (ТЭЛА), имплантація штучних клапанів серця

Необхідно враховувати, що результати протромбінового тесту можуть спотворюватися наявністю в крові вовчаночного антикоагулянта та інших інгібіторів згортання (гепарин), що нерідко утруднює контроль за эфектом застосування кумаринів.

Тромбіновий час

Принцип. Визначають час згортання плазми під впливом тромбіну (стандартизованого по активності на контрольній нормальній плазмі). Тромбіновий тест характеризує плин кінцевого етапу згортання крові - швидкість перетворення фібриногену у фібрин і залежить від змісту фібриногену й інгібіторів, що блокують дію тромбіну, а також самоскладання фібрин-мономера.

Реактиви. 1. Трис-Буфер, 0,05М (або буфер Михаеліса, рн 7,3 - 7,4). 2. Розчин тромбіну в буфері активністю 14 - 16 с. Робочий розчин реактиву готується в пластиковій або силіконірованій пробірці й використовується в день дослідження. Зберігається при кімнатній температурі.

Примітка. Розведення тромбіну у фізіологічному (0,9%) розчині хлориду натрію або його витримка при +37°С небажані, тому що при цьому швидко знижується активність ферменту.

Матеріал для дослідження. Цитратна бідна тромбоцитами плазма.

Хід визначення. До 0,2 мл досліджуваної плазми, прогрітої на водяній лазні при +37°С у плин 1 хв., додають 0,2 мл розчину тромбіну (який до дослідження повинен мати температуру +18...+25°С, не прогрівати!). Негайно включають секундомір і відмічають час згортання. Визначення проводиться мануально або на коагулометрі.

Читання результатів. Результат виражають у секундах, порівнюють час згортання в контрольній нормальній і досліджуваній плазмі. У нормі тромбіновий час становить 14 - 16 с. Подовження його може бути обумовлено наступними причинами:

• гіпофібриногенемією;

• дисфібриногенемією (молекулярними дефектами фібриноге­ну);

• підвищеним вмістом у плазмі продуктів деградації фіб­риногена/фібрину (ПДФ), у т.ч. при фібринолітичній терапії;

• присутністю в крові антикоагулянтів прямої дії (гепа­рина, переважно нефракційованого або звичайного, гірудина, синтетичних антитромбінів і ін.).

Повна незгортаємость за тромбіновим тестом спостерігається відразу ж після внутрішньовенного введення великої дози гепарина й у термінальній фазі гострого ДВЗ-синдрому. Завдяки високій чутливості тромбінового часу до гепарину методикою користуються для контролю за гепаринотерапією. Помилкові результати можуть бути отримані при дослідженні крові, узятої із судинного катетера з гепариновим покриттям. У цьому випадку необхідно попереднє видалення із плазми гепарина. Примітка. У ряді випадків при визначенні тромбінового часу використовують розчин тромбіну, що має активність при згортанні контрольної нормальної плазми 8 – 10 с. або 16 - 21 с.

Визначення концентрації фібриногену (за М.В. Ремплінг та

П. Гаффіей)

Метод базується на здібності 10,5 % розчину Nа₂S0₃ викликати специфічне зсідання фібриногену і продуктів його деградації, які містять Аа, Вв та У-ланцюги білку (фрагменти X та У).

Реактиви. 1. 10,5 % розчин Na₂S0₃ у дистильованій воді. 2. 4 М мочевина 0,1 М NаОН.

Хід дослідження. До 0,1 мл бідної тромбоцитами плазми крові, стабілізованої цитратом натрію або гепарином, дода­ють 0,9 мл 0,5 % розчину Na₂S0₃. Суміш інкубують у водяній бані при 37 град. на протязі 15 хвилин і центрифугують після цього при 4000 об./хв. на протязі 15 хвилин. Супернатант відкидають, а до осілої частини додають 0,4 мл розчину Na₂S0₃ з послідуючим центрифугуванням при 4000 об./хв. на протязі 15 хвилин. Осадок розчиняють у 5 мл 4 М сечовини у 0,1 М та кип’ятять при 100 град. на протязі 15 хвилин. Вимірюють поглинення гідролізату на спектрофотометрі у кюветі з товщиною робочого шару 1 см при довжині хвилі 280 нм проти контрольної проби. Контрольну пробу обробляюсь так само, як і дослідну, але замість плазми крові беруть 0,9 % розчин NаСІ. Концентрацію фібриногену у мг/мл вираховують по фор­мулі:

фібриноген (мг/мл) = 36,6 х А,

де А - поглинення проби при довжині хвилі 280 нм.

Читання результатів. У нормі вміст фібриногену – 2 - 4 мг/мл або 2 - 4 г/л. Зниження концентрації фібриногену може мати спадковий або набутий характер. При спадковому дефіциті фібриногену порушується біосинтез білка пе­чінкою або утворюється аномальна його молекула. Набутий дефіцит фібриногену виявляється при захворюваннях печінки, а також при ДВЗ синдромі. В останньому випадку білок витрачається на утворення фібрину. Тромболітична терапія стрептокіназою, урокіназою та іншими препаратами, а також дефібринування анкродом (арвіном) викликають транзиторне зниження концентрації фібриногену.

Підвищення вмісту фібриногену у крові спостерігається при запальних процесах, злоякісних пух­линах та цілому ряді інших патологічних процесів. У зв'язку з цим гіперфібриногенемія не завжди свідчить про розвиток передтромботичного стану.

Хронометричний метод (за Клаусом)

Принцип. Визначають час згортання розведеної цитратної плазми надлишком високоактивного тромбіну. Час згортання при цьому залежить від концентрації фібриногену в плазмі, яку визначають за калібровочним графіком. Методику можна виконувати тільки на коагулометрах.

Реактиви та обладнання. 1. Тромбін людини активністю 100 NIH од/мл, вміщує каолін. 2. Трис-буфер, 0,05 М (або буфер Міхаеліса), рН 7,3-7,4. 3. Стандартна калібровочна плазма з відомим вмістом фібриногена. 4. Коагулометр (мануальні варіанти методики мають не задовільну точність визначень).

Матеріал для дослідження. Цитратна бідна тромбоцитами плазма.

Нижче приводиться опис методу на прикладі використання діагностикума "Фібриноген-тест", фірми Технологія-Стандарт.

Хід визначення. Калібровка коагулометра за фібриногеном (побудова калібровочної кривої). Флакон з ліофільно вису­шеної калібровочної плазми розчиняють в необхідній кількості дистильованої води (відповідно з иіструкцією до на­бору реагентів). Отримують калібровочну плазму з концентрацією фібріногену, яка дорівнює 2,50 г/л. Виконують її послідовні розве­дення (табл.19).

А. Визначення часу згортання розведень калібровоч­ної плазми. У кювету коагулометра розміщують 0,2 мл одного із розведень плазми та інкубірують при +37°С на протязі1 хв, потім вносять 0,1 мл розчину тромбіну, який до дослідження зберігають при кім­натній температурі (+18...+25°), та починають відлік часу згортання. Цим способом досліджують всі розведення калібровочної плазми. Кількість фібриногена в г/л в кожній пробі визначають шляхом множення концентрації фібриногену у калібровочній плазмі на коефіцієнт перерахунку (див табл. 17). Наприклад, якщо концентрація фібриногена указана такою, що дорівнює 2,50 г/л, то для розведе­ння калібровочної плазми 1:5 концентрація фібриногену оцінюється слідуючим чином : 2,50 г/л х 2,0 = 5,0 г/л. В коагулометр по­парно вводяться значення концентрації фібриногена (в розведеннях калібровочної плазми) та відповідний їм час згортання.

Б. Визначення концентрації фібриногену в досліджуваному зразку. Перед проведенням аналізу плазма хворого розводиться в 10 разів(1+9), для чого 0,2 мл плазми, взятої в пробірку, змішують з 1,8 мл буферного розчину. В кювету коагулометра вносять 0,2 мл розведеної плазми та інкубірують при +37°С на протязі 1 хв, потім вносять 0,1 мл розчину тромбіну ( який має температуру +18...+25°С) та визначають час згортання.

Таблиця 19

Схема розведень калібровочної плазми при визначенні концентрації фібріногену за хронометричним методом

№ розве дення	Плазма + буфер, мл	Розве­дення	Коефіцієнт перерахунку	Концентрація фібріногена, г/л
1 2 3 4	0,2 + 0,8 0,5 розведення 1 + 0,5 0,5 розведення 2 + 0,5 0,5 розведення 3 + 0,5 мл	1:5 1:10 1:20 1:40	2,0 1,0 0,5 0,25	5,0 2,5 1,25 0,625

Примітка. Концентрація фібріногену (г/л) приводиться за відношенням до плазми, яка розведена в 10 раз. Розчини калібровочної плазми використовують для побудови калібровоч­ного графіку на протязі перших 2 г.

Читання результатів. Сучасні коагулометри після введе­ння калібровочних даних розраховують концентрацію фіб­ріногену в досліджуваній плазмі автоматично. Якщо конструкцією коагулометра не передбачене уведення калібровочних даних, а тому немає автоматичного розрахунку результатів, можна скористатися калібровочним графіком. При визначенні концентрації фібриногену (в разведенні плазми 1:9) та отриманні результату, близького до крайніх значень діапазону, який вимірюється, (менш як 1,0 г/л або болше 6,0 г/л), рекомен­дується повторити аналіз з іншим розведенням досліджуваного зразка плазми (відповідно 1:4 - при низкій концентрації фіб­ріногену та 1:19 - при високій). Отриманий результат вмісту фібриногену відповідно зменшують або збільшують в 2 рази.

В нормі, концентрація фібриногену в плазмі, визначена за хронометричним методом, складає 2,0-4,0 г/л.

Примітка. Методика Клауса має високу точність визначення, не чуттєва до гепарину та використовується в більшості закордонних лабораторій.

Аутокоагуляційний тест (АКТ) (за Б. Беркарда і співавт. модифікований Л. 3. Баркаганом)

АКТ є у деякій мірі аналогом АПТЧ і при виборі методики дослідження слід визначати АПТЧ, ураховуючи його розповсюдженість. Роль АКТ значно підвищується у педіатричній практиці (Баркаган З.С., 2001). Це стандартизована методика, яка відображає динаміку зростання, а по­тім інактивації тромбопластин-тромбіновоі активності у досліджуваній крові. Стандартизація фосфоліпідної та контактної активації початкової фази процесу зсіданні крові досягається використанням гемолізату еритроцитів досліджуваного. У тесті не використовуються тромбопластин, тромбін та інші нестандартизовані реактиви, а результати його виражаються безвідносно до показників, одержаних на випадкових зраз­ках нормальної плазми. Це суттєво підвищує точність та відображення одержуваних результатів.

Реактиви. 1. 3,8 % розчин цитрату натрію. 2. 0,222 % розчин хлориду кальцію.

Хід дослідження. Негайно після забору кров стабілізують цитратом натрію (9:1), після чого 0,3 - 0,5 мл її відливають в окрему пробірку для приготування гемолізат-кальцієвої суміші (ГКС). Решту крові для одержання плазми центрифугують при 1500 об./хв. на протязі 10 хвилин. Плазму розливають по 0,2 мл у 10 центрифугованих пробірок та поміщають на водяну баню (37 градусів). У окрему пробірку набирають 2 мл розчину СаС1₂. Потім у неї додають 0,1 мл залишеної для приготування ГКС крові і негайно вмикають секундомір. Пробірку з цією сумішшю струшують і уміщають у водяну баню (37 градусів). У кожну із пробірок з плазмою, що знаходяться на водяній бані, додають по 0,2 мл ГКС послідов­но через 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50 і 60 хвилин з моменту приготування цієї суміші. У кожній пробірці визначають час зсідання плазми. Одержані результати у секундах переводять у відсоткові показники зсідаючої активності по таблиці 20.

Читання результатів. По даним АКТ у відсотках на міліметровому папері викреслюють аутокоагулограму та визначають слідуючи її параметри: А - зсідаюча активність на 2-й хвилині інкубації ГКС (норма: М - 15,4 % + 11,8 м + 2,9). Цей параметр найбільш мінливий, оскільки відображає самі початкові етапи утворення тромбопластину та тромбіну у ГКС.

МА - максимальна зсідаюча активність (норма: М – 100%);

Т1 - хв. - час досягнення 1/2 максимальної зсідаючої активності (норма 3,7 хв.);

Т2 - хв. - час досягнення максимальної зсідаючи активності (норма 10 хв.);

Ф - час зниження тромбопластин-тромбіновоі активності до 50% МА;

ІІТ - індекс інактивації тромбопластину та тромбіну розраховується за формулою:

МА в %

зсідаюча активність на 60 хв. інкубації

Клінічне тлумачення. Висхідна частина кривої АКТ відображає динаміку наростання і максимальну активність (МА) тромбопластину та тромбіну у досліджуваній крові при стандартизованій контактній та фосфоліпідній (за рахунок гємолізованих еритроцитів) активації процесу зсідання. Низхідна частина кривої характеризує швидкість та інтенсивність інактивації тромбіну за рахунок дії антитромбіну Ш та продуктів фібринолізу. Таким чином, АКТ дає уяву про стан як прокоагулянтного, так і антикоагулянтного кілець зсідаючої системи крові, відображаючи кінетику обох процесів.

При дефіциті факторів внутрішнього механізму утворення протромбокінази (ХП, XI, УШ), а також X, V та ІІ факторів, як при надміру швидкодіючих антикоагулянтів, зменшуються параметри А та особливо МА, подовжується час Т1 та Т2. При значній активації фібринолізу спостерігається більш круте зниження низхідної частини кривої аутокоагулограми.

Мало відображаються на показниках тесту дефіцит фактору VII, що бере участь тільки у зовнішнь­ому механізмі утворення протромбінази, а також порушення зсідання крові, зумовлене дефіцитом тромбоцитів або тромбоцитарного фактору Ш (оскільки аналогічний фосфоліпідний фактор міститься у гемолізаті еритроцитів).

Варіанти методики. Якщо дослідника цікавить лише величина максимальної тромбопластин-тромбінової активності крові, АКТ може виконуватися в укороченому варіанті, що скорочує час дослідження і зменшує витрати крові хворого. Так, для контролю за лікуванням гепарином досить досліджувати зсідаючу активність лише на 10-й хвилині інкубації ГКС, для діагностики гемофілії - на 10-й, 20-й, 30-й хвилинах, для вияву гіперкоагуляції - на 4, 6, 8 та 10 хвилинах.

Джерела помилок. АКТ відрізняється простотою виконання, точністю та високим рівнем відображення результатів. Головна причина помилок: погана якість або неточність приготування розчину хлориду кальцію (зберігання у нещільно закупореній посудині, підвищення вологості, недостатнє прожарювання, пропитування парами кислот або лугів та ін.). На показники тесту впливають різні зміни гематокриту та вміст у крові еритроцитів. При поліглобуліях з гематокритом більше 70 % зменшуються параметри МА та А, збільшу­ється час Т2. При значних анеміях відмічається помірне зниження МА та зміщення вершини аутокоагулограми з 10 на 8 хвилину. Зміни вмісту гемоглобіну у межах від 12 до 18 г/л, еритроцитів - від 3,5 до 6 млн у мкл та тематокритного показника від 35 до 70 % на результати істотно не впливають.

Таблиця 20

Переклад результатів АКТ (у сек) у показники коагуляційної активності у процентах (за Л.З. Баркаганом)

Час, сек	Показник %	Час, сек	Показник %	Час, сек	Показник %	Час, сек	Показник %
7	108	35	36	63	12,5	91	4,4
8	105	36	34	64	11,8	92	4,2
9	103	37	33	65	11,3	93	4
10	100	38	31,5	66	10,8	94	3,9
11	93	39	30,5	67	10,5	95	3,7
12	88	40	29,5	68	10,1	96	3,6
13	85	41	28	69	9,8	97	3,4
14	83	42	27,5	70	9,4	98	3,3
15	79	43	26	71	9	99	3,2
16	76	44	25,5	72	8,6	100	3,1
17	73	45	24,5	73	8,2	101	3
18	70	46	23,5	74	8	102	2,8
19	68	47	23	75	7,7	103	2,7
20	65	48	22	76	7,4	104	2,6
21	62	49	21	77	7,2	105	2,5
22	59	50	20,5	78	7	106	2,4
23	58	51	19,5	79	6,7	107	2,3
24	56	52	18,5	80	6,5	108	2,2
25	54	53	18	81	6,2	109	2,1
26	51	54	17,3	82	6	110	2
27	49	55	16,5	83	5,8	111	1,9
28	47	56	16	84	5,6	112	1,8
29	46	57	15,5	85	5,4	113	1,6
30	44	58	14,8	86	5,2	114	1,5
31	43	59	14,5	87	5	115	1,4
32	41	60	13,8	88	4,9	116	1,3
33	39	61	13,5	89	4,7	117	1,2
34	37	62	12,8	90	4,5	118	1,2

Експрес-метод для диференційної діагностики гемофілії (за Л. 3. Баркаганом)

На основі аутокоагуляційного тесту можна провести перше орієнтовне обстеження хворих, у яких є підозра на гемофілію. Визначається здатність нормальної плазми, адсорбованої ВаSО₄ та нормаль­ної старої сироватки виправляти показники аутокоагуляційного тесту. ВаSО₄ - плазма містить VIII та XI фактори, але у ній відсутній IX фактор. У старій сироватці містяться 1Х та Х1 фактори, але відсутній VIII фактор.

1. Спочатку визначають час зсідання плазми хворого під впливом його ж гемолізат-кальцієвої суміші (ГКС) після 4 хв. інкубації цієї суміші. При гемофілії він різко подовжується (1 пробірка).

2. Потім проводять таке ж саме дослідження, але з додаванням до ГКС нормальної ВаSО₄-плазми (2 пробірка).

3. Точно таке ж дослідження, але з додаванням нормальної старої сироватки (3 пробірка).

Якщо початково подовжений час зсідання нормалізується у 2-й пробірці, то у хворого гемофілія А (дефіцит УІІІ ф.). Якщо відмічається нормалізація часу у 3-й пробірці, то це гемофілія В (дефіцит 1Х ф.). При дефіциті XI ф. (гемофілія С) нормалізація відбувається у обох пробах.

Реактиви. 1. 3,8 % розчин цитрату натрію. 2. Розчин СаС1₂ М/50 (0,222 %).

3. Нормальна, бідна на тромбоцити плазма, адсорбована ВаSО₄: до 1 мл плазми додають 100 мг ВаS0₄, ретельно перемішують 40 хвилин при 37 градусах, центрифугують 15 хв. при 4000 об./хв. 0,1 мл ВаSО₄ - плаз­ми розводять фізіологічним розчином 1:4. Готується безпосередньо перед дослідженням. 4. Сироватка крові здорової людини витримується на протязі 24 годин при 37 градусах. Перед дослідженням сироватку центрифугують 10 хв. при 2000 об./хв. Розводять сироватку фізіологічним розчином у 9 разів.

5. Гемолізат-кальцієва суміш (ГКС) готується так само, як і при проведенні аутокоагуляційного тес­ту (див. АКТ).

Хід дослідження. У центрифужну пробірку, що містить 0,3 мл 3,8 % розчину цитрату натрію, набирають 3 мл крові, перемішують. 0,5 мл цієї крові відливають у іншу пробірку для приготування ГКС. Кров, що залишилася, центрифугують 10 хв. при 1500 об./хв. Плазму багату тромбоцитами розливають у 3 пробірки по 0,2 мл і ставлять на водяну баню при 37 град. У три інші пробірки наливають по 2 мл СаС1₂.

Гемолізат-кальцієва суміш: у одну з пробірок, яка містить розчин СаС1₂ (2 мл), додають 0,1 мл цільної крові досліджуваного, змішують та вмикають секундомір. ГКС, що утворюється, витримують 4 хв. (37 град.). Потім 0,2 мл ГКС додають до одного із раніше приготованого зразків плазми (1 пробірка), вмикають секундомір та реєструють час зсідання. У 2-гу пробірку з розчином СаС1₂ додають 0,1 мл ВаSО₄ - плазми, потім - 0,1 мл крові досліджуваного. Через 4 хв. інкубації при 37 град. 0,2 мл цієї суміші додають до плазми хворого (2 пробірка) і визнача­ють час зсідання. У 3-тю пробірку з розчином СаС1₂ додають 0,1 мл нормальної сироватки і 0,1 мл крові досліджувано­го. Через 4 хв. інкубації 0,2 мл цієї суміші додають до плазми хворого і реєструють час зсідання (3 пробір­ка).

Кількісне визначення факторів VIII та IX

Визначається каолін-кефаліновнй час розведеної бідної на тромбоцити плазми крові хворого і стандартної контрольної плазми, одержаної від групи здорових осіб. Зумовлене розведенням зниження концентрації усіх плазмових факторів зсідання, окрім досліджу­ваних, компенсується додаванням плазми крові хворого із явно відомим значним дефіцитом факторів УІІІ та 1Х. Як активатори використовуються кефалін або інші замісники фактору ІІІ тромбоцитів і каолін. Додавання кефаліну (еритрофосфатиду) виключає порушення зсідання тромбоцитарного генезу і робить метод чутливим до дефіциту плазмових факторів зсідання та до- лишку у плазмі антикоагулянтів. Каолін використовується для активації контактної фази зсідання. У результаті на показники тесту впливає лише дефіцит досліджуваного фактору. За допомогою стандартної кривої розведення визначають ступінь дефі­циту факторів УІІІ та IX.

Реактиви. 1. Субстратна дефіцитна плазма. Використовується: бідна на тромбоцити плазма крові хворих тяжки­ми формами гемофілії А та В із встановленим різко вираженим дефіцитом факторів VIII та IX (1 - 3 %), одержувана при центрифугуванні крові на протязі 15 хвилин при 2000 об. Як консервант використовують 3,8 - відсотковий розчин цитрату натрію (9:1). Для отримання великої кількості субстратної плазми до­цільно провести хворим тяжкою формою гемофілії А та В плазмаферез, який дозволяє одержати 250 мл плазми із 500 мл крові хворого.

2. Стандартна плазма. Контрольну бідну на тромбоцити плазму заготовляють так само, як і плазму крові досліджуваних хворих та субстратну плазму. Оскільки у здорових осіб вміст у крові факторів УІП та IX коливається у значних межах, доцільно використовувати пул донорської плазми, яка складається із рівних обсягів 10 - 20 зразків плазми крові здорових осіб. Зразки стандартної та субстратної плазми зберігаються не більше трьох годин при 4 град. або на протязі місяця при 20 град.

3. Суспензія каоліну (білої глини) в еритрафосфатиді. Використовується 0,1-відсотковий розчин еритрофосфатиду в ізотонічному розчині (0,85%) хлориду натрію. Готується суспензія 0,025 г каоліну у 0,5 мл 0,1 % розчину еритрофосфатиду і обсяг доводиться до 5 мл ізотонічним розчином хлориду натрію. Одержану суспензію перемішують на протязі 10 хвилин на магнітній мішалці при кімнатній температурі.

4. Імідазольний буфер рН 7,4 готується із концентрату (5 мл концентрату + 95 мл дистильованої води).

5. Розчин хлориду кальцію 0,025 моль/л.

Хід дослідження. Всі зразки плазм зберігаються на льоду на протязі усього часу дослідження. Визначення проводить­ся у стандартних умовах рН (імідазольний буфер), контактної (каолін) та фосфоліпідної (кефалін або еритрофосфатид) активації процесу зсідання. У центрифужні пробірки, які встановлені на водяній бані (37 град.), послідовно вводять по 0,1 мл розведеної буфером цитратноі плазми хворого (1:10), субстратної плазми та суміш каоліну з еритрофосфатидом. Вміст пробірок ретельно перемішують та інкубують на водяній бані на протязі 3 хвилин. Потім вводять 0,1 мл розчину хлориду кальцію і визначають час зсідання.

Побудова калібровочної кривої.

Для побудови калібровочноі кривої використовують слідуючи розведення стандартної плазми:

Розведення плазми	1:10	1:20	1:40	1:100	1:200
% від фактора VІІІ, ІХ від норми	100	50	25	10	5

Читання результатів. Час зсідання стандартної контрольної плазми, розведеної імідазольним буфером у співвідношенні 1:10, приймається за 100 %. На білогарифічному папері по осі ординат відкладають час зсідання у секун­дах, а по осі абсцис - рівень дефіцитного VІІІ або IX фактору у відсотках. Кут нахилу кривої залежить від якості субстратної плазми. Нормальне значення факторів УІІІ та IX становить 70 - 200 %. Метод використовується для діагностики дефіциту факторів УІІІ та IX, визначення тяжкості гемофілії та контролю за замісною терапією хворих трансфузіями плазми або концентратами відповідних фак­торів зсідання.

Для визначення факторів УІІІ і ІХ можуть використовуватись відповідні фірмені контрольні і субстратні плазми, а також набори реагентів для визначення АПТЧ фірм Технологія-Стандарт і Ренам (Росія).

Тест з отрутою гюрзи звичайної (лебетоксовий тест) (ЛЕТ) (Баркаган З.С., 2001) - для визначення дефіциту ф. Х, У, ІІ, І

Принцип. Визначають час згортання плазми при активації процесу отрутою гюрзы, яка активує фактор X в присутності іонів кальцію та фактора V. Гемокоагулююча дія отрути гюр­зи підсилюється фосфоліпідним компонентом (кефаліном або тромбоцитами).

Реактиви. 1. Лебетокс - робочий розчин отрути гюрзи, яку отримують слідуючим чином: на дистильованій воді готують ма­точний розчин отрути із розрахунку 10 мг кристаллічної речовини на 5 мл води (2 мг/мл). Маточний розчин залишають на 1 добу при +2...+8°С для стабілізації активності (дозрівання). Із маточного розчину шляхом послідовних розведень дистильованою водою готують робочі розчини отрути гюрзи (до концентрації 0,02 и 0,002 мг/мл). Конкретне розведення зміїної отрути з необхідною активністю згортання вибирається експериментальним шляхом, для чого визначається лебетоксовий час в контрольній нор­мальній плазмі. 2. Хлорид кальцію, 0,277% розчин.

Матеріал для дослідження. Цитратна бідна тромбоцитами плазма.

Хід визначення. 1. В кювету коагулометра або в пробірку (при мануальному визначенні) вносять 0,1 мл досліджуваної плазми та 0,1 мл робочого розчину лебетокса.

2. Інкубірують 1 хв при +37°С.

3. Добавляють 0,1 мл розчину хлориду кальцію, який має тем­пературу +37°С, включають таймер коагулометра або секундомір та визначають час згортання.

Аналогічним чином визначають час згортання в кон­трольній нормальній плазмі.

Читання результатів. Результат виражають в секундах, зрівнюючи час згортання контрольної нормальної та досліджуваної плазми. В нормі показники ЛЕТ коливаються в межах від 23 до 27 с (25,0+2,0 с). При співпаданні результатів ЛЕТ в досліджуваному та контрольному зразках плазми (різниця в часі згортання не більше як 3 с) робиться висновок про відсутність дефициту факторів X, V, II и I (фібриногену). Подовження часу згортання в указаному тесті порівняно з контролем більше, ніж на 3 с, свідчить про ізо­льований або сочетаний дефіцит факторів X, V, II и I (фібриногену). При дефіциті фактору VII, на відміну від протромбінового тесту, час згортання в ЛЕТ не збільшується. Гепаринотерапія та прийняття непрямих антикоагулянтів подовжують час згортання в ЛЕТ.

Варіанти методики. Проба з ослабленим (розведеним в дистильованій воді до активності 35-55 с) отрутою гюрзи використовується для виявлення вовчаночного антикоагулянта при діагностиці антифосфоліпідного синдрому - АФС (див. розділ 8.1.2.4). Тест з отрутою гюрзи являється аналогом тесту з отрутою гадюки Рассела, який використовується за кордоном.

Таблиця 21

Тести, які розповсюджені в практичній охороні здоров’я для диференціації дефіциту факторів протромбінового комплекса (Баркаган З.С., 1988).

Лабораторні тести	Показники при дефіциті факторів
	УІІ	Х	У	ІІ
АПТЧ, АКТ, тест генерації тромбопластину	Н	ЧП	ЧП	ЧП
Протромбіновий час	П	П	П	ЧП
Те ж при корекції:
старою сироваткою	Н	Н	П	П
ВаSО4-плазмою	НП	П	Н	П
старою плазмою	Н	Н	П	Н
Лебетоксовий час	Н	П	П	П
Корекція в тестах змішання з плазмою без факторів:
УІІ	-	+	+	+
Х	+	-	+	+
У	+	+	-	+
ІІ	+	+	+	-

Примітка: Н – нормальні показники; ЧП – частіше нормальні; П – патологічні показники; ЧП – частіше патологічні; + корекція є; - корекції не має. Стара сироватка – 24 год ; стара плазма – декілька діб при + 4 град, яка дає протромбіновий час більше 60 с.

Визначення активності фактору ХІІІ (за методом В. П. Балуди та співавт.)

Метод заснований на визначенні часу розчинення згустку фібрину у розчині кислої щавлевокислої сечовини при додаванні до реагуючої суміші монойодоцтової кислоти, яка блокує активність фактору ХІІІ. Час розчинення згустку залежить від активності фактору ХІІІ досліджуваної плазми.

Реактиви. 1,34% розчин щалевокислого натрію або 3,8% розчин лимонокислого натрію, 0,5% розчин монойодоцтової кислоти, 0,025 М розчин хлористого кальцію, 0,12% розчин кислої щавлево­кислої сечовини.

Хід дослідження. Кров набирають з вени у пробірку, змішують з антикоагулянтом (9:1), центрифугують 7 хв. при 1500 об./хв. Багату на тромбоцити плазму переносять до іншої пробірки і до початку дослідження збері­гають при 4 град. До 0,2 мл плазми додають 0,1 мл розчину монойодоцтової кислоти і 0,4 мл розчину хло­ристого кальцію. Змішують струшуванням та залишають на 20 хвилин при кімнатній температурі. До утвореного згустку додають 2,0 мл розчину кислої щавлевокислої сечовини. Визначають час повного розчи­нення фібринового згустку при постійному струшуванні. Дослідження проводять паралельно у двох пробірках для кожної проби і обчислюють середній час.

Розрахунок. Активність фактору ХІІІ досліджуваної плазми визначають за формулою:

АФ ХІІІ = А/В х 100, де А - час лізису фібрину досліджуваної плазми; В - час лізису фібрину здорової людини. У нормі лізис згустку відбувається на протязі 70 секунд, що дорівнює 100 %.

Читання результатів. Цей метод дає кількісну оцінку концентрації фактору ХІІІ.

В останній час використовують методики з діагностикумом «Factor XIII» фірми Boehringer Mannheim, або хромогеним субстратом.

Методи, необхідні для діагностики синдрому ДВЗ

Паракоагуляційні тести

Для виявлення РФМК в клініці традиційно використовуються паракоагуляційні тести: этаноловий (ЕТ) та протамінсульфатний (ПСТ)¹. При відомих достоїнствах вони недостатньо інформатив­ні, дають завідомо неправдиві позитивні результаты при гіперфібріногенемії та неправдиві негативні при гіпофібриногенемії. При цьому вони лише якісно відображають процес трансформаіїи фібріногену в фібрін, в зв’язку з чим багато дослідників вважають ці тести такими, що зас­таріли та виходять із використання. Кількісні та напівкількісні варіанти ПСТ, які наводяться в довідковій літературі є мало точними та мають низьку відтворюваність із-за розходжень властивостей різних видів протамінсульфату. Крім того, протамінсульфат пов’язується з гепарином, у зв’язку з чим у хворих, які отримують гепаринотерапію, ПСТ найчастіше показує не правдиві негативні результати. Тому опис ПСТ не включений нами в цю роботу.

Визначення фібрин-мономерних комплексів етаноловим тестом (за X. Годал і співавт.)

Принцип. Поява маси (паракоагулята), яка схожа з желе, в плазмі через 10 хв після добавки до неї 50% етанолу говорить про наявність в ній комплексів фібрін-мономерів з фібріногеном та продуктами його деградації плазмином, тобто свідчить про наявність в плазмі активного тромбіну.

Матеріал для дослідження. Цитратна багата тромбоцитами плазма.

Реактиви. 50% етанол (важливо дотримуватися точності концентрації, яка повинна обов’язково перевірятися спиртометром).етанол розводять дистильованою водою.

Хід визначення Збагачену тромбоцитами плазму в об’ємі 0,4 мл змішують з

0,15 мл 50% розчину етанолу, пробірку струшують та включають секундомір. Через 10 хв інкубації (при температурі +18...+25°С), злегка нахиляючи пробірку, в минаючому світлі визначають, чи появився в плазмі згусток схожий з желе (не пластівці та не крупнозернисті коагуляти).

Читання результатів. При наявності в досліджуваній плазмі комплексів фібрин-мономеру з продуктами фібрінолізу та фібіиногеном під впливом етанолу утворюється згусток, який схожий з желе. Результат читається рівно через 10 хв як позитивний або негативний. Гель та згусток, які утворилися пізніше до уваги не приймають. При виконанні тесту при температурі повітря вище +26°С ре­зультат може бути не правдиво негативним, в зв’язку з чим при високій температурі повітря в приміщенні необхідно проводити термостатування на водяній лазні.

Метод визначення розчинних фібрин - мономерних комплексів (РМФК) у сироватці (за З.С. Баркаганом та співавт., 1998)

За допомогою отрути ефи зсідають у сироватці, яку одержують після коагуляції плазми тромбіну або у інших тест-системах, додаткову фракцію фібриногену (фібринового пулу). Додатково виявляють цю фракцію і після видалення частини РФМК етанолом.

Реактиви. 3% розчин цитрату натрію, розчин тромбіну, активність якого 15,0 х 2,0 сек., 50% розчин етанолу у дистильованій воді, робочий розчин отрути ефи, активність якої 30,0 + 2,0 сек.

Хід дослідження. Етап 1. Визначають вміст фібриногену у плазмі додаванням до неї 15 сек. тромбіну. Етап 2. Сироватку, одержану після видалення утвореного тромбіном згустку, розділяють на дві частини (рівні). До першої частини додають отруту ефи із розрахунку 0,2 мл розчину на 1,0 мл сироватки і визначають кількість фібриногену, що додатково зсядеться, РФМК і ранніх ПДФ. Етап 3. До сироватки у другій пробірці додають 50% етанол по методиці проведення етанолового тесту. Згусток, що утворюється під впливом етанолу (якщо він формується), видаляють скляною паличкою, а дрібні кришки та пластівці осаджують центрифугуванням при 1500 об./хв. на протязі 5 хв. До вмісту пробірки додають робочий розчин отрути ефи з розрахунку 0,2 до 1,0, суміш інкубують на протязі 20 хв. при 37 град., після чого проводять оцінку результатів. Утворення під впливом отрути мікрозгустків, які мають вигляд крихт та пластівців, оцінюють одним плюсом, більші крихти та згустки - двома плюсами, утворення консолідованого згустку - трьома плюсами. Якщо утворюється більш стійкий згусток, проводять кількісну оцінку "розчиного фібрину" у сироватці.

Читання результатів. У здорових людей після зсідання тромбіну у сироватці практично не залишається РФНК і ПДФ і отрута додаткового зсідання не викликає. При наявності РФМК сироватковий ехитоксовий тест буває позитивним, що е свідком тромбінеміі, говорять про внутрішньосудинне зсідання крові. Поява під впливом отрути додаткового згустку і пластівців після проведення етанолового тесту свідчить про наявність у плазмі РФМК, ехитоксовий тест свідчить про тромбінемію та внутрішньосудинне зсідання крові.

В останні роки разроблений та отримав широке розповсюдження паракоагуляційний ортофенантроліновый тест (ФТ), який відображує вміст розчинного фібрину в плазмі та наявність тромбинемії. Гель-хроматографічний аналіз плазми поряд з апробацією цього тесту у багатьох лабораторіях показав, що ФТ дозволяє достатньо надійно не тільки якісно, але й кількісно визначати вміст розчинного фібрину в плазмі, в тому числі в умовах експрес-діагностики. Це відкрило перспективи для більш точного обліку виразності внутрісудинного згортання та динамічного контролю за ефективністю та достатністю терапії ДВС-синдромів та тромбозів. Співставлення частоти позитивних результатів ФТ з показниками інших паракоагуляційних тестів показало, що на різних стадіях ДВС-синдрома ФТ виявляє РФМК частіше (в 83-100% спостережень), ніж ПСТ (в 76-79%) и ЕТ (в 65-87%). Треба звернути увагу також на той факт, що ФТ більш чуттєвий, ніж ЕТ та ПСТ.

Лише при формах ДВС-синдрома, з глибокою гіпофібріногенемією, які гостро протікають (тобто є катастрофічними), попередньо високі показники ФТ можуть знижуватися, що характерно і для інших паракоагуляційних тестів.

Кількісне визначення фібрин-мономерних комплексів (продуктів паракоагуляції) орто-фенантроліновим тестом (ФТ) (за В. А. Елікомовим та А. П. Момотом)

Поява у плазмі пластівців при додаванні до неї орто-фенантроліну свідчить про наявність у ній неполімеризуючих (заблокованих) високомолекулярних фібрин-мономірних комплексів (РФМК).

Реактиви. 1. 0,33 М (0,78%) розчин орто-фенантроліну гідрохлориду у дистильованій воді, готується перед дослідженням і використовується на протязі перших двох годин. 2. 3,8% розчин цитрату натрію.

Хід дослідження. Кров одержують з вени силіконірованою голкою і змішують у силіконірованій пробірці з розчином цитрату натрію у співвідношенні 9:1. Суміш центрифугують при 1500 об./хв. на протязі 5 хв., після чого відокремлену плазму центрифугують повторно при 4000 об./хв. на протязі 20 хв. для видалення тромбоци­тів.

Бідну на тромбоцити плазму в обсязі 0,1 мл змішують при кімнатній температурі у пробірці або на предметному склі з 0,1 мл розчину орто-фенантроліну, вмикають секундомір. Безперервно похитуючи пробірку у прохідному світлі відмічають час від моменту змішування реагентів до початку появи перших пластівців. Облік проводиться на протязі 2 хв.

Читання результатів Тест визначається позитивним, якщо у плазмі з’являються добре видимі у прохідному світі пластівці. Показання тесту виражають у секундах та по каліброваній кривій або за допомогою таблиці (див.) пере­водять у кількісний вміст комплексів фібрин-мономеру.

Принцип побудови каліброваної кривої. Плазму, що містить фібрин-мономер у кінцевій концентрації 28 х 10 у степені -2 г/л, розводять нор­мальною донорською плазмою у 1,5, 2, 4 та 8 разів, цим знижують кінцеву концентрацію фібрин-мономерних комплексів до 21,0; 14,0; 7,0; 3,5 х 10 у степені -2 г/л. По описаній вище методиці визначають час початку утворення преципітатів у кожному розведенні. Усі вимірювання роблять тричі і, при достатнь­ому збігові результатів, береться середня арифметична величина. По осі ординат відкладається десятковий логарифм у секундах, а по осі абсцис - логарифм концентрації фібрин-мономерних комплексів у г/л.

Читання результатів. У здорових людей пластівці не утворюються на протязі 120 секунд і більше, інакше кажучи орто-фенантроліновий тест у нормі дає негативний результат. Цей тест стає позитивним при внутрішньосудинному зсіданні крові. Кількісний характер оцінки результатів дозволяє проводити динамічний контроль за ефективністю гемокорекційної терапії.

Таблиця 22.

Переклад результатів орто-фенантролінового тесту у сек. в кількісний вміст фібрин-мономерних комплексів в еквіваленті фібрин-мономеру

Час, сек	Концентрація г/л х10	Час, сек	Концентрація г/л х10	Час, сек	Концентрація г/л х10
5	28,2	25	8,8	45	5,3
6	27,8	26	8,4	47	5,2
7	26,2	27	8,2	49	5,0
8	24,5	28	8,0	51	4,9
9	22,2	29	7,7	54	4,8
10	21,0	30	7,5	57	4,7
11	19,0	31	7,3	60	4,6
12	17,5	32	7,0	63	4,5
13	16,2	33	6,8	66	4,4
14	15,0	34	6,6	69	4,3
15	14,2	35	6,4	72	4,2
16	13,2	36	6,3	75	4,2
17	12.4	37	6,2	79	4,1
18	11,8	38	6,1	83	4,0
19	11,4	39	6,0	87	3,9
20	11,0	40	5,8	91	3,8
21	10,4	41	5,7	97	3,7
22	10,0	42	5,6	110	3,6
23	9,6	43	5,5	120	3,5
24	9,2	44	5,4	Вище	3,0

Діагностичне значення. ФТ принципово відрізняється від етанолового тесту та інших застарілих паракоагуляційних тестів більш високою чутливістю (3.0 – 3,5 мкл/100 мл, в еквіваленті фібрин-мономера) і можливістю кількісно оцінювати концентрацію розчиного фібрина в плазмі (тобто визначати тромбінемію) як при діагностиці внутрішньосудинного зсідання крові, так і під час лікування хворих. Тест може призначатися для оцінки ефективності і достатності антикоагулянтної терапії за кінцевому її результату – ліквідації тромбінемії.

Визначення фібрин-мономерних комплексів та продуктів деградації фібрину та фібриногену за допомогою стафілококового реагенту (тест склеювання стафілококу) (за Г.В. Черкашиною та співавт.)

Метод базується на здатності деяких штамів золотистого стафілокока, що вміщують на своїй оболонці фактор склеювання (Клампінг-фактор), аглютинувати у присутності комплексів фібрин-мономеру і ранніх продуктів деградації фібриногену (фрагменти X та У). При використанні методу розведення сироватки визначається концентрація в ній даних компонентів фібриногенового пулу.

Реактиви. І.Трис-буфер, рН 7,4. 2. Стафілококовий реагент. 10 мл сухого стафілококового реагенту вносять у 1 мл трис-буфера з рН 7,4 і перемішують 40 - 60 хв. Готовий реагент придатний для роботи на протязі двох годин при кімнатній температурі і 24 години при температурі 4 град. З.Тромбін. 4. Е-амінокапронова кислота.

Хід дослідження. З вени беруть кров у пробірку з 3,8% розчином цитрату Na у співвідношенні 9:1, центрифугують при 1500 об./хв. на протязі 15 хв. і відсмоктують. Приготування сироватки для визначення ПДФ. В 1 мл трис-буфера додають 12 мг Е-амінокапронової кислоти, 15 мг тромбіну. До 0,1 мл одержаної суміші приливають 0,2 мл трис-буфера та 0,1 мл досліджуваної плазми ^; поміщають у термостат на 15 хв. при 37 град. Після інкубації з одержаної сироватки готують ряд розведень 1:1, 1:3, і:7, 1:15 і т.п. На темне скло розміщують 50 мкл стафілококового діагностикуму і перемішують. Облік результатів проводять через 2 хв.

Читання результатів. Чутливість вітчизняного стафілококового діагностикуму дорівнює 0,1 мг % фібриногену. Таким чином, при утворенні преципітату тільки у першій пробі кількість ПДФ дорівнює 0,4 мг %. У першій та другій пробах - 0,8 мг %, у першій, другій та третій пробах - 1,6 мг %, тощо. У нормі кількість продуктів деградації фібрину та фібриногену, що визначається даним методом, не перевищує 6 мг %.

Визначення D-димера

Принцип. Тест заснований на здатності часток латекса, які покри­ті моноклональними антитілами до D-димеру (продукту лізиса поперечнозшитого фібрину), агглютинувати при змішуванні з плазмою крові, яка вміщує D-димер. Тест проводять з різними роз­веденнями досліджуваної плазми, а про кількість D-димера в зразку роблять висновок по тому найбільшому розведенню плазми, в якому ще ви­являеться агглютинація. На показання теста не впливає вміст в плазмі фибриногена, ранніх продуктів фібриноліза (фрагментів X и У) та фрагментів D і Е. Визначення D-димера можна проводити також в сироватці крові та інших біологічних рідинах.

Нижче наводиться опис методики на прикладі наборові реаген­тів "FDP-Slidex direct" фірми BioMerieux. Аналогічні набори ви­пускаються фірмами Boehringer Mannheim, Immuno и др.

Матеріал для дослідження. Цитратна бідна тромбоцитами плазма або сироватка крові.

Реактиви. 1. Латекс-реагент - суміш частинок латекса, які навантажені антитілами до D-димеру - в контейнері-дозаторі. 2. Позитивний контроль - вміщує в контейнері-дозаторі. 3. Розчин D-димера (в концентрації більше як 500 нг/мл). 4. Негативний контроль – розчин, який не вміщує D-димера - в контейнері-дозаторі. 5. Глициновий буфер (0,1 М),який вміщує хлорид натрію (0,15 М), рН 8,2. 6. Пластини із картону з робочою поверхнею чорного кольору з нанесеними на неї кільцами-обмежниками (лунками). 7.Палички для перемішування.

Примітка. Всі реагенти знаходяться в робочому розведенні та постачені дозаторами.

Хід визначення. Якісний варіант. В 3 лунки на пла­стині вносять по 1 краплі позитивного контролю (1-а лунка), негативного контролю (2-а лунка) або 30 мкл (3-я лунка) досліджуваної плазми. Потім в кожну лунку вносять по 1 краплі латекс-реагента та перемішують вміст лунок за допомогою паличок, які входять до складу набору. Пластину похитують на протязі 2 хв, після чого визначають наявність агглютинації частинок латексу. В лунці, до якої вносився негативний контроль, агглютинації не повинно бути, а в лунці з позитивним контролем, повинна відмічатися добре видима агглютинація.

Напівкількісний варіант. При позитивному результа­ті проби в якісному виконанні методики виконують напівкількісне визначення, для чого плазму перед дослідженням розводять буфером в 2, 4, 8 и более разів. Всі розведення плазми досліджують за описаною вище методикою.

Читання результатів. В разі присутності агглютинації в лунці, в яку була розміщена проба досліджуваної плазми, результат розці­нюють як позитивний (концентрація D-димера вище 500 нг/мл). Відсутність агглютинації в пробі з досліджуваною плазмою розцінюють як негативний (концентрація D-димера нижче 500 нг/мл). В напівкількісному варианті методики знаходять найбільше розведення зразка плазми, в якому ще визначається агглюти­нація частинок латекса. Потім перемножають ступінь розведення зразка на чутливість діагностикуму (500 нг/мл), в результаті отримують шукану концентрацію D-димера.

Рівень D-димера підвищується (більш як 500 нг/мл) при масивному внутрішньому згортанні крові (тромбози магістральних вен, ТЕЛА), при ДВС-синдромах різного генезу. Високі показники тесту спостерігаються і при лікуванні хворих активаторами фібріноліза (стрептокіназою, тканинним активатором плазміногена -ТПА, авелізіном і т. ін.), у зв’язку з чим метод використовується в ком­плексі з визначенням фібріногена для контролю такої терапії.

Кількісні варіанти визначень D-димера.Кількісне визначення D-димера як маркера тромбонемії має більш високе діагностичне значення, тому що дозволяє визначати виразність в сукупності як внутрісудинного згортання крові, так і фібріноліза, відстежувати ефективність антитромботичної терапії.Разом з цим, такі визначення є достатньо дорогими, потребують застосування спеціального обладнання ( таких пристроїв, що зчитують або визначених типів коагулометрів). Наприклад, при використанні рефлектометра NycoCARD READER II, дос­ягається визначення D-димера в интервалі від 0,1 до 20,0 мг/л, з точністю до 0,1 мг/л або 100 нг/мл (при нормальному вмісту D-димера - до 0,3 мг/л).

Визначення гепарин-кофакторної активності антитромбіну ІІІ (ПАТ) (за Р. Л. Бік та співавт.)

У присутності гепарину антитромбін ІІІ перетворюється з повільно діючого у швидкодіючий інгібітор тромбу. Швидкість інактивації тромбіну пропорційна активності антитромбіну ІІІ зразка. Зниження зсідаючої активності інгібітором приводить до збільшення часу зсідання фібриногену.

Реактиви. 1. 3,8% розчин цитрату натрію. 2. 0,05 М трис- НСІ буфер рН 7,4, що містить 0,15 М NaСІ (6,05 г трису та 8,77 г NаСІ на 1л дистильованої води). 3. Розчин гепарину (20 од/мл) у тім самім буфері. 4. Розчин тромбіну (10 NІН од/мл) у буфері (0,2 мл тромбіну повинні викликати зсідання 0,3% розчину фібриногену за 23 сек. при 37 град.). 5. 0,2 % розчин фібриногену у тім самім буфері (розчин фібриногену готується на коагулюючому білку). У разі використання бичачого фібриногену виробництва Каунаського підприємства бакпрепаратів слід брати навісок N 6 мг/мл.

Приготування дефібринованої плазми: кров, змішану з 3,8% цитратом натрію у співвідношенні кров/консервант 9:1, центрифугують при 4000 об./хв. на протязі 20 хвилин. Відсмоктують бідну на тром­боцити плазму крові і видаляють фібриноген прогріванням зразка на водяній бані при 56 град на протязі 5 хв. (контроль температури у плазмі строго по термометру!). Зразок ставлять у холодильник (-8, -12 град) на 10 хв., а далі центрифугують 10 хв. при 3000 об./хв. Для визначення використовують супернатант.

Хід дослідження. У пластикову або силіконіровану пробірку, поміщену у водяну баню (37 град), додають 0,075 мл розчину гепарину і 0,4 мл розчину тромбіну. Через 30 сек. інкубації відбирають 0,2 мл суміші і переносять у пробірку з розчином фібриногену, яку попередньо нагрівають на протязі 1 хв. при 37 град. Вмикають секундомір і реєструють час зсідання фібриногену. Активність антитромбіну ІІІ знаходять по каліброваній кривій, що показує залежність часу зсідання фібриногену від вмісту (активності) антитромбіну ІІІ. Побудова каліброваної кривої: плазму крові, стабілізовану цитратом натрію, здобуту від 10 донорів, дефібринують по описаній вище методиці та змішують у рівних обсягах у одній пробірці. Після дефібринування вносять у 5 пробірок: 0,025 (100%, І од.); 0,020 (80%, 0,8); 0,015 (60%, 0,6); 0,010 (40%, 0,4) та 0,005 (20%, 0,2) дефібринованоі плазми. Доводять обсяг проб, за виключенням першої, до 0,025 мл 0,05 М трис-НСІ буфером 7,4, що містить 0,15 М NаСІ. Визначають гепарин-кофакторну активність кожного з розведень (усі вимірювання повторюють тричі і при достатньому збігові беруть середнє арифметичне з них). Будують калібровану криву на пів- логарифмічному папері, де на осі абсцис із міліметровим масштабом відкладають активність антитромбіну ІІІ у % співвідношенні з використаними розведеннями, а по осі ординат з логарифмічним масштабом - десятковий логарифм часу зсідання у сtr. Результати виражають у %, або у од/мл, приймаючи активність антитромбіну ІІІ у 1 мл цитратної плазми крові, що дорівнює 100% або 1 од.

Читання результатів.Антитромбін ІІІ - основний інгібітор тромбіну та фактору Ха, на частину якого припадає близько 80% антитромбіновоі активності плазми крові. Гепарин, що взаємодіє з антитромбіном ІІІ значно збільшує швидкість інактивації інгібітором ферментів системи гемостазу, у зв'язку з чим антитромбін ІІІ володіє, так званою, гепарин-кофакторною активністю. Зниження рівня антитромбіну ІІІ супроводжується тромбоемболічними ускладненнями. Існують спадкові - генетично обумовлені, та набуті форми дефіциту інгібітору. Спадковий дефіцит антитромбіну ІІІ зустрічається у популяції з частотою 1:5000 і може бути викликаний як зниженням біосинтезу інгібітору, так і аномаліями його молекули. Набутий дефіцит ан­титромбіну ІІІ зумовлений: 1) споживанням на інактивацію ферментів зсідаючої системи при її активації (ДВЗ-синдром, великі хірургічні втручання, гемодіаліз та ін.); 2) порушенням біосинтезу інгібітору при гострих ушкодженнях печінки та цирозах ; 3) втратою антитромбіну ІІІ з біологічними рідинами внаслідок підвищеної судинної проникливості (нефротичний синдром, гострі запальні захворювання кишок, плазмаферез та ін.). Зниження рівня антитромбіну ІІІ спостерігається при гепаринотерапіі, введені аспарагінази та естрогенів. При зниженні вмісту інгібітору до 60-70 % введення гепарину не дає клінічно значимого антикоагулянтного ефекту.

Скринінговий метод оцінки гепарин-кофакторної активності ПАТ

Принцип. При додаванні стандартної дози гепарину до плазми крові тромбі-новий час подовжується в залежності від вмісту в неї ПАТ та факторів, які блокують дію гепарину (білки «гострої фази», фосфоліпідні мембрани та інші). За ступенем подовження тромбінового часу оцінюють індивідуальну достатність антикоагулянтного ефекту гепарину. Наводимо метод на прикладі використування діагностикуму «Гепарин-тест» фірми «Технологія-Стандарт».

Матеріал та методи дослідження: цитратна бідна на тромбоцити плазма крові

Далі приводиться опис методу на прикладі використання діагностикуму “Гепаринтест" фірми Технологія-Стандарт.

Реактиви. 1. Тромбін людини. Розводиться за допомогою добавки 10 мл фізіологічного (0,15 М) розчину хлориду натрію. 2. Робочий розчин тромбіну отримують розведенням маткового розчину тромбіну розчинником для тромбину в співвідношенні 1:17 з тим, щоб його активність при додаванні до контрольної нормальної плазми (при змішуванні рівних за об’ємом реагентів) дорівнювала 15-16 с. 3. Буфер для розведення гепарину (трис-НСІ, 0,15 М, рН 7,3-7,4). 4. Гепарин (сухий). Розводиться фізіологічним (0,15 М) розчином хлориду натрію до концентрації, яка подовжує тромбіновий час згортання в контрольній нормальній плазмі с 15-16 до -80 с.

Хід визначення. В пробірку (або кювету коагулометра) вно­сять 0,1 мл контрольної нормальної плазми та інкубірують 1 хв при +37°С. Потім вносять 0,1 мл робочого рзчину тромбіну, який до дослідження зберігають при кімнатній температурі (+18...+25°С), включають секундомір або таймер коагулометра та реєструють час згортання,який повинен бути в межах 65-80 с.Аналогічно визначають час згортання в контрольній нор­мальній плазмі.

Читання результатів. За отриманими даними розраховують індекс антитромбінового резерву плазми (АРП)за формулою:

АРП = Б/Кх 100%,

де К - тромбін-гепариновий час згортання в контрольній нормальній плазмі; Б - той же показник в плазмі хворого.

В нормі АРП складає 80-120%. Діагностичне значення має зниження АРП, яке може залежати:

• від зниження рівня ПАТ або зменьшення спорідненості його до гепари­ну;

• від надлишкового нагромадження в плазмі хворого нейтралізуючих антикоагулянтну дію гепарину білків "гострої фази" (фіб­риногену, С-реактивного білка, а₂-кислого гликопротеїну та ін.

Визначення гепарин-кофакторної активності ПАТ використовують, в основному, для діагностики ДВЗ-синдрому і диференціальної діагностики тромбофілій, які пов’язані чи не пов’язані з дефіцитом ПАТ), а також для контролю за лікуванням їх, визначенням достатності замісної терапії.

Визначення плазміногену в еуглобуліновій фракції плазми крові

(за І.К. Слобожанкіною та З.Д. Федоровою (1973) у модифікації А.К. Дорохової (1980))

Для виявлення активності плазміногену осаджують активатори плазміногену, плазмін та фібриноген з еуглобуліновою фракцією плазми крові при кислому значенні рН середовища і низькій температурі. Плазміноген активують стрептокіназою. Плазмін, який утворюється, викликає лізіс еуглобулінового згустку.

Реактиви. 1. 1% розчин оцтової кислоти у дистильованій воді. 2. 0,07 М фосфатний буфер рН 7,2. 3. 0,025 М СаС1₂ у дистильованій воді. 4. стрептокіназа ("целіаза") 50 000 ОД В ампулі. Вміст однієї ампули стрептокінази розчинити у 10 мл фосфатного буфера рН 7,2. Із маточного розчину (5000 од/мл) перед визначенням готується робочий розчин стрептокінази методом його розведення тим самим буфером у співвідношенні 1:9.

Хід дослідження. Осадження еуглобулінової фракції плазми крові проводять внесенням 0,5 мл тестуємої плазми у пробірку з 6,0 мл охолодженої (+2…+8 град.) та підкисленої 0,1 мл 1 % розчину оцтової кислоти. Пробу перемішують перевертанням, ставлять у холодильник (-8…-12 град.) на 10 хв., центрифугують при 3000 об./хв. на протязі 3 - 5 хв. Супернатант відкидають та видаляють його осад зі стінок пробірки смужкою фільтровального паперу. До осаду еуглобулінів додають 0,25 мл робочого розчину стрептокінази (125 од) у фосфатному буфері і повністю розчиняють осадок за допомогою скляноі палички. До розчину осаду додають 0,25 мл розчину СаС1₂ і перемішують похитуванням. Пробірку з пробою ставлять у термостат (37 град.) і після утворення згустку визначають час його лізису. Час лізісу еуглобулінової фракції плазми крові, активованої стрептокіназою, пропорціональний вмісту плазміногену.

Читання результатів. У здорових людей час лізису згустку становить 10 - 20 хв. Зниження рівня плазміногену, яке часто є супутником передтромботичних станів і тромбозу, приводить до подовження часу лізису еуглобулінової фракції плазми крові, активованої стрептокіназою, або неповного лізису.

Визначення фібринолітичноі активності еуглобулінової фракції плазми крові (за С. Невіровською)

Метод базується на здатності фібринолітичних ферментів еуглобулінової фракції плазми крові, яка осаджується при кислому значенні рН середовища і низькій температурі, викликати лізис згустку. У складі еуглобулінової фракції міститься 25 % плазмового фібриногену, протромбін, деякі інші фактори зсідання крові, активатори плазміногену, плазміноген та плазмін.

Рактиви. 1. Боратно-сольовий розчин (9 NaС1 та 1 г Nа₂В₄О₇ х 10 Н₂О у 1 л дистильованої води). 2. 1% розчин оцтової кислоти у дистильованій воді. 0,025 М розчину СаС1₂ у дистильованій воді.

Хід дослідження. До 4 мл охолодженої у крижаній бані (0 град) дистильованої води, розлитої у пробірки і підкисленої до рН 5,2 (додано 0,075 мл мл 1% розчину оцтової кислоти), додають 0,25 мл плазми крові. Вміст пробірки обережно перемішують перевертанням та інкубують при -6 град, -12 град, на протязі 10 хв. Далі пробу центрифугують при 1500 об./хв. на протязі 7 хв. Супернатант зливають, пробірку перекидають на фільтрувальний папір та видаляють залишки рідини із стінок пробірки смужкою фільтрувального паперу. Осад розчиняють у 0,25 мл боратно-сольового розчину за допомогою скляної палички. Пробірку ставлять у во­дяну баню (37 град.) та додають 0,25 мл розчину СаС1₂. Після утворення згустку визначають час його повного лізису у хв. У здорових людей час лізису еуглобулінової фракції плазми крові становить 120 - 240 хв.

Читання результатів. Скорочення часу лізису еуглобулінового згустку свідчить про активацію фібринолізу, а подовження, яке частіше буває при передтромботичному стані або тробмозі, про зниження фібринолітичної активності крові.

Примітки. Під час тромболітичної та антикоагулянтної терапіі замість розчину СаС1₂ для утворення згустку з еуглобулінової фракції слід використовувати той самий обсяг розчину тромбіну, активність якого 10 МІН од/мл (див. "Дослідження гепарин-кофакторної активності антитромбіну ПІ").

Визначення фібринолітичної активності крові (за Л. Фернлей та співавт.)

Принцип методу заснований на лізисі фібринового згустку крові плазміном, що утворюється при активації плазміногену активаторами, які присутні у зразку крові. Попереднім розведенням крові досягаєть­ся дисоціація комплексів плазміну та активаторів плазміногену з їх інгібіторами.

Реактиви. Розчин тромбіну, активність якого 100 МІН од/мл у 0,2 М ацетатному буфері рН 7,4, який містить 1 мм цитрату натрію (0,2 мл тромбіну повинні викликати зсідання 0,2 мл 0,3 % розчину фібриногену за 10 сек. при 37 град,). 0,2 М ацетатний буфер рН 7,4, що містить 1 мМ цитрату натрію (16,4 г СН_ЗСООNа розчинити у 800 мл дистильованої води і довести рН до 7,4 2% розчином СН_ЗСООН. Спільний об'єм довести до 1 л та додати 340 мг цитрату Nа).

Хід дослідження. У пробірки Салі розливають по 1,7 мл буфера, охолодженого до 0 град, та зберігають їх у крижаній бані. 0,2 мл крові з консервантом або дестабілізованої переносять у пробірку з буфером, змішують та додають 0,1 мл тромбіну, знову перемішують. Інтервал від внесення проби крові у пробірку з буфером до додавання тромбіну не повинен перевищувати 3 хв. Потім пробірки поміщають у водяну баню (37 град) і відмічають момент утворення згустку. Визначають інтервал від утворення згустку до його повного лізису (час лізису згустку розбавленої крові). Мінімальний час лізису згустку крові у людини 220 - 260 хв.

Читання результатів. Метод чутливий головним чином до зміни вмісту активаторів плазміногену, і в меншій мірі, - до активаторів плазміну. При збільшенні концентрації цих компонентів (у разі стимуляції фібринолізу) час лізису згустку крові скорочується, а при зниженні, що є ознакою передтромбозу, подовжується.

Заключення

Як видно із перелічених методів діагностики, існує багато показників, які можуть допомогти верифікувати діагноз, як причину анемічного чи геморагічного синдрому. Але тільки комплексний підхід до діагностики при ретельному аналізі отриманих результатів з анамнезом хвороби, особливостями клінічного перебігу захворювання дозволять встановити діагноз і призначити своєчасну адекватну терапію.

Метою даного посібника було посилити увагу лікарів різного профілю до невідкладних станів з порушенням еритропоезу та гемостазу, запропонувати більш розповсюджений комплекс їх диференціально-діагностичних досліджень, рекомендації по наданню допомоги у цих екстремальних ситуаціях та планової терапії. Для самоконтролю засвоєння отриманого навчального матеріалу запропоновані запитання і клінічні завдання.

ЛІТЕРАТУРА

1. Баркаган З.С. Геморрагические синдромы. - М., 1988. - 525 с.

2. Баркаган З.С. Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. – Москва.: Ньюдиамед, 2001. - 286 с.

3. Баркаган З.С. Место компонентов системы гемостаза в терапии ДВС-синдрома и тромбофилий // Гематол. і трансфузіол. – 2005. – Т. 50, № 6. – С. 9 – 12..

4. Бебешко В.Г., Бруслова Є. М. Диагностика и лечение гемофилии на современном этапе // Український журнал гематол. і трансфузіол. - 2003. - № 2 (3). - С. 44 - 48.

5. Бєссмєльцев С.С. Механізми згортання крові // Укр. журнал гематол. та трансфузіол. – 2005. - №4. – С. 48 – 56.

6. Бурчинський С.В. Современные подходы к лечению гемофилии // Журнал практичного лікаря. - 2001.- № 5.- С. 45 - 48.

7. Виговська Я.І., Логінський А.А., Мазурок А.А. Гематологические синдромы в клинической практике.- К.: Здоров’я, 1981. - 294 с.

8. Виговська Я.І. Геморагічні захворювання. - Медична література, Львів: ВАТ Більбус, 1999. - 240 с.

9. Виговська Я.І. Дисеміноване внутрішньо судинне зсідання крові // Український журнал гематол. і трансфузіол. - 2002.- № 3 (2). - С. 60 - 65.

10. Виговська Я.І. Система гемостазу // Український журнал гематол. і трансфузіол. - 2003.- № 5 (3). - С. 53 - 59.

11. Виговська Я.І. Спадкові тромбоцитопатії // Український журнал гематол. і трансфузіол. - 2004. - № 5 (3). - С. 52 - 57.

12. Видиборець С.В. Метаболізм заліза та методи діагностики його порушень. Сучасні принципи лікування залізодефіцитної анемії // Лікарська справа. - 2002. - №2. – С. 9 -16.

13. Видиборець С.В. Патофізіологічні механізми формування залізодефіцитних станів та сучасні підходи до призначення оральних форм препаратів заліза для їх профілактики та лікування // Лікарська справа. - 2003. - №1. - С. 8 - 12.

14. Вознюк В.П. Томилин В.В. Наследственные коагулопатии // Журнал практического врача. - 2002. - №5. - С. 14 - 18.

15. Воробйов П.А. Анемический синдром в клинической практике. - Москва.: Ньюдиамед, 2001. - 165 с.

16. Виговська Я.І., Кароль Ю.С., Бужерак Н.Ф. Набуті тромбоцитопенії // Журнал сучасного лікаря. Мистецтво лікування. - 2006.- № 1. - С. 62 - 66.

17. Гаврилов О.К., Файнштейн Ф.Е., Турбина Н.С. Депрессии кроветворения. - М.: Медицина, 1987. - С. 29 - 115.

18. Гайдукова С.М., Видиборець С.В. Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура // Журнал сучасного лікаря. Мистецтво лікування. - грудень 2004.- № 10 (016). - С. 26 -30.

19. Гайдукова С.М., Видиборець С.В., Колесник І.В. Залізодефіцитна анемія. - К.: Науковий світ, 2001. - 130 с.

20. Гематологія і трансфузіологія: Підручник / За редакцією проф. Гайдукової С.М. К.: ВПЦ „Три крапки”, 2001. - 533 с.

21. Городецький В.М., Шулутко Є.М., Галстян Г.М. Реанимация в гематологической клинике - насущная проблема // Терапевт. арх. - 2002. – Т. 74, №7. - С. 5 - 10.

22. Гусева С.А., Вознюк В.П., Бальшин М.Д. Болезни системы крови. - К.: Логос, 2001. - 541 с.

23. Гусєва С.А. Рекомбинантный фактор свертывания крови VII (НовоСевен) в терапии патологии гемостаза // Український журнал гематол. і трансфузіол. - 2002. - № 3 (2). - С. 52 - 57.

24. Гусєва С.А., Вознюк В.П. Болезнь Виллебранда // Український журнал гематол. і трансфузіол. - 2004. - № 1 (4). - С. 11 - 16.

25. Дворецький Л. І. Железодефицитная анемия. – Москва.: Ньюдиамед АО, 1998. - 40 с.

26. Дворецький Л.И. Дифференциальный діагноз при анемии // Российский мед. журн. -1999. -№2. - С. 39 - 44.

24. ДВС-синдром – патогенез. www.soros.karelia.ru/projects/1998/diagnostika/gemato/razdel7/razdel7_7_1_3.htm (5 КБ) 20.04.2001 — строгое соответствие

25. Залізодефіцитна анемія / Я.І. Виговська,А.А. Мазурок, Л.М. Лукавецький, З.В. Маслак // Журнал сучасного лікаря. Мистецтво лікування. – 2006. - № 1. – С. 26 - 28.

26. Идельсон Л.И., Дидковский Н.И., Ермильченко Г.В. Гемолитические анемии. - М., 1975.-- 287 с.

27. Идельсон Л.И. Мегалобластные анемии. - М., 1979. - 23 с.

28. Идельсон Л.И. Гипохромные анемии. - М., 1981. - 188 с.

29. Идельсон Л.И. Ошибки в диагностике В-12- и фолиеводефицитной анемии // Терапевт. арх. - 1986. - № 9. - С. 144 - 150.

30. Идельсон Л.И. Методы лабораторной диагностики гемолитических и мегалобластных анемий. Учебное пособие. - М., 1990. - 30 с.

31. info@gematologia.ru

32. Ингибиторы при гемофилии А. Часть 2. Современные клинические подходы для нейтрализации их действия / Н.М. Ананьева, С. Лакруа-Демаж, М.В. Ованесов та інш. // Гематол. і трансфузіол. – 2005. – Т. 50, № 6. – С. 32 – 34.

33. Информационная система поддержки врача-терапевта в Інтернет. Заболевания внутренних органов. Петрозаводськ. Кировский НИИ гематологи и переливання крови. - http:www/soros.karelia/ru/projects/1998/diagnostika/gemato/ gemato_main.htm

34. Клінічна гематологія / Під ред. проф. А.Ф. Романової.–Мед., 2006.–452 с.

35. Колосков А.В. Современные представления о показаниях к трансфузии свежезамороженной плазмы // Гематол. та трансфузіол. – 2005. – Т. 50, № 6. – С. 41 – 45.

36. Купирование кровотечений (при наличии ингибитора) у больных с наследственной и приобретенной формами гемофилии / Л.Н. Якунина, Н.Н. Лаврентьєва, Е.В. Агеенкова и др. // Гематол. и трансфузиол. - 2003. - №4. - С. 40 - 45.

37. Нарушения системы гемостаза. Патофизиология.-- коагулопатии ... патологическая физиология, свертывание крови, антикоагулянты, остановка кровотечения, тромб, фибрин, фибриноген, тромбоцит, коагулопатии. - max.1gb.ru/learn/pf23.shtml (17 КБ) - строгое соответствие

38. Неотложные состояния в клинике внутренних болезней / За ред. А.І. Грицюка. - К., 1985. - С. 446 - 461.

39. Неотложные состояния и экстренная медицинская помощь / Справочник под редакцией Е.И.Чазова, М.: Медицина, 1988. - С. 10 – 14, 179 – 206.

40. Новак В.Л., Логінський В.Е., Стасішин А.В. Гемофілія: клініка, діагностика, лікування // Журнал сучасного лікаря. Мистецтво лікування. – 2006. - № 1. – С. 18 – 22.

41. Нове в гематології та трансфузіології / Школа післядипломної підготовки під ред. С.М. Гайдукової, 2004. - Вип. I. - 153 с.

42. Нове в гематології та трансфузіології / Школа післядипломної підготовки під ред. С.М. Гайдукової, 2005. - Вип. 3. - 207 с.

43. Опыт применения десмопрессина (препарат „Эмосинт” в терапии болезни Виллебранда и перспективы его использования при других видах кровоточивости / З.С. Баркаган, В.Н. Константинова, Е.Ф. Котовщикова, Т.А. Суханова // Гематолог. и трансфузиол. - 2004. - №1. - С. 40 – 42.

44. Острая массивная кровопотеря и диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови / А.И. Воробъёв, В.М. Городецкий, С.А. Васильев и др. // Терапевт. арх. - 1999. – Т. 71, №7. - С. 5 - 12.

45. Плазменное звено гемостаза и антигемостаза. Нарушения гемостатических и антигемостатических механизмов плазмы. Коагулопатии. Виды. этиология. патогенез. Особенности этиологии и патогенеза. - diplom.kokoc.com.ru/referata/page408.htm (4 КБ) 14.03.2004 - строгое соответствие.

46. Посібник з клінічної лабораторної діагностики / За ред. В.Г. Денисюка. - К.: Здоров’я, 1992. - 295 с.

47. Применение памбы для лечения геморрагических заболеваний и синдромов / М.В. Суховій, В.П. Вознюк, В.В. Томілін, О.А. Місурагіна // Український журнал гематол. і трансфузіол. - 2003. - № 3 (2). - С. 57 - 59.

48. Програмное трансфузионное лечение острой кровопотери и кислородно-транспортная функция крови / А. Точенов, С. Куликов, А. Рагимов // Врач. - 2000. - №11. - С. 26 - 27.

49. Проект Виртуальная Гематология. / Редкие коагулопатии.-- www.gematologia.ru/CCinit.php?id=diag_9 (41 КБ) - строгое соответствие.

50. Романова А.Ф. Гипопластическая и апластическая анемия. – Київ.: Здоров’я, 1982. – 152 с.

51. Руководство по гематологии: в 3 томах / За ред. А.І. Воробйова. - М.: Ньюдиамед, 2005. - Т. 3. - 416 с.

52. Румянцев А.Г., Бабкова Н.В., Чернов В.М. Применение рекомбинантного активированного фактора коагуляции VII в клинической практике // Гематол. и трансфузиол. - 2003. - №5. - С. 36 - 40.

53. Семенка В.І., Суховій М.В. Дослідження основних показників якості різних методів визначення протромбінового часу // Український журнал гематол. і трансфузіол. - 2003. - № 2 (3). - С. 35 - 39.

54. Справочник по функциональной диагностике / Под ред. проф. И.А. Касирского. - М., 1970. - С. 396 - 407.

55. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования / Под ред. Е.А. Кост. - М., 1975. - 385 с.

56. Справочник по дифференциальной диагностике внутренних болезней / Под ред. Г.П. Матвейкова.- Минск.: Беларусь, 1990. - С. 365 - 427.

57. Справочник по гематологии / Серия «Медицина для Вас», Ростов-на-Дону.: Феникс, 2000. – 384 с.

58. Томілін В.В., Вознюк В.П. Трансфузійна допомога хворим з коагулопатіями // Журнал практичного лікаря. - 2004. - № 3. - С. 5 - 7.

59. Томілін В.В. Гипопроконвертинемия: современный вигляд на проблему // Український журнал гематол. і трансфузіол. - 2003. - № 3 (2). - С. 41 - 44.

60. Томілін В.В., Вознюк В.П., Суховій М.В. Фібриногенопатії // Український журнал гематол. і трансфузіол. - 2002. - № 3 (2). - С. 48 - 51.

61. Томілін В.В., Вознюк В.П. Трансфузійна допомога хворим з коагулопатіями // Журнал практичного лікаря. - 2004. - №3. - С. 5 - 7.

62. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования / Под ред. Е.М. Тареева. - М., 1985. - С. 35 - 36.

63. Характеристика імунних розладів у хворих на гемофілію з виявленим інгібітором залежно від замінної трансфузійної терапії / В.П. Руденко, О.В. Стасишин, Г.Б. Лебедь та ін. // Лікарська справа. - 2001. - №3. - С. 39.

64. Чернов В.М. Гемостаз – новые возможности // Гематол. и трансфузиол. - 2002. - №5. - С. 45 - 46.

65. Шамов И. Железодефицитные анемии. // Врач. - 1997. -№6. - С.10 - 11.