Хід роботи.
Спочатку треба приготувати солодову витяжку. Для цього беруть наважку масою 10,00 г подрібненого солоду, переводять у мірну колбу місткістю 100 мл, додають 10 мл фосфатного буфера і доводять до мітки дистильованою водою. Суміш ретельно перемішують і витримують в термостаті при температурі 30°С та заміряють час витримки (ЗО хв.) Одержану витяжку фільтрують через паперовий фільтр з наступним використанням фільтрату для проведення аналізу.
Для проведення ферментативної реакції 25 мл розчину крохмалю змішують у широкій пробірці з 23 мл дистильованої води і 2 мл солодової витяжки. Суміш ставлять у термостат при температурі 30°С і засікають час витримки. Через кожну хвилину відбирають з пробірки на білу фарфорову пластину краплю рідини і змішують її з краплею розчину йоду. Відмічають час, коли йод перестане змінювати своє забарвлення. Аналіз триває 10-20 хв. Якщо забарвлення йоду зникає менше ніж через 10 хв, визначення проводять з 1 мл солодової витяжки і 24 мл води. Якщо реакція триває довше ніж 20 хв, треба збільшити кількість солодової витяжки. Але за будь-яких умов загальний об'єм реакційної суміші має бути 50 мл. Величину АА розраховують за формулою, од./г:
АА=
де 0,25 - маса крохмалю в 25 мл розчину, г;
60 - перерахунок на одиницю часу, хв;
ά - маса солоду в реакційному середовищі, г;
t - час оцукрювання, хв.
Визначення амілолітичної активності ферментного препарату
Аналіз виконують за методикою, яка викладена вище, з урахуванням деяких особливостей.
Для приготування витяжки ферментного препарату зважують 0,1-1,0 г цієї речовини, переводять у мірну колбу на 100 мл, додають 10 мл ацетатного буфера з рН=4,7 і доводять вміст колби до мітки дистильованою водою. Суміш ретельно перемішують, витримують в термостаті при температурі 30°С 1 год., а потім фільтрують через паперовий фільтр. Одержаний фільтрат використовують для проведення ферментативної реакції.
Визначення оцукрюючої активності солоду поляриметричним методом
Осахарююча активність ферментних препаратів характеризує властивість їх амілолітичних ферментів гідролізувати крохмаль до редукуючих цукрів: мальтози, глюкози або їх суміші.
Метод заснований на визначенні швидкості ферментативної реакції гідролізу крохмалю, яка встановлюється за зменшенням кута обертання площини поляризації внаслідок утворення низькомолекулярних декстринів під дією ферментів на крохмаль.
За одиницю активності оцукрюючої активності (ОА) беруть таку кількість ферменту, яка у суворо визначених умовах (рН-4,7-4,9,температура - 50°С, час дії ферменту 30 хв.) гідролізує до низькомолекулярних декстринів 1 г крохмалю, що становить 10 % уведеного в реакцію.
Прилади, посуд і реактиви: поляриметр СУ-3, термостат, пробірки, 2%-й розчин картопляного крохмалю, 30%-й розчин сульфату цинку, 15%-й розчин гексаціано-(ІІ)-ферату калію, І н. розчин соляної кислоти.
Хід роботи.
Спочатку готують солодову витяжку. Для цього беруть наважку масою 10,00 г подрібненого солоду, переводять у мірну колбу місткістю 100 мл, додають 10 мл фосфатного буфера і доводять до мітки дистильованою водою. Суміш ретельно перемішують і витримують у термостаті при температурі 30°С і засікають час витримки (ЗО хв.). Одержану витяжку фільтрують через паперовий фільтр з наступним використанням фільтрату для проведення аналізу.
Фільтрат солодової витяжки використовують для аналізу. Ферментативну реакцію проводять у суворо визначених умовах: (температура 50+0,5°С, рН-4,7-4,9, тривалість реакції ЗО хв., об'єм реакційної суміші ЗО мл (20 мл субстрату і 10 мл ферментного розчину).
Для аналізу беруть дві пробірки. В одну наливають 20 мл субстрату і ставлять у термостат з температурою 50+0,5°С, де її витримують 5-10 хв., а потім до пробірки додають 10 мл фільтрату солодової витяжки з такою самою температурою. Суміш перемішують і витримують в термостаті ЗО хв. Після цього пробірку виймають із термостата і додають 1 мл розчину 1 н, соляної кислоти для інактивації ферментів. Для осаджування білків та освітлення додають 1 мл розчину сульфату цинку, а після перемішування -1 мл розчину гексоциано-(ІІ)-ферату калію.
Одночасно готують контрольний дослід. Для цього в іншу пробірку послідовно наливають 10 мл фільтрату солодової витяжки, 1 мл розчину 1 н. соляної кислоти, по 1 мл розчинів сульфату цинку і гексоциано-(ІІ)-ферату калію і 20 мл субстрату.
Вміст обох пробірок перемішують і фільтрують. Обидва фільтрати поляризують у поляриметричній трубці довжиною 200 мм. Після вимірювання отримують значення поляризації: ПК - контрольного розчину і ПД - дослідного розчину. Різниця (ПК - ПД) має бути не менше як 0,2 і не більше як 2,5. ОА розраховують за рівнянням, од./г:
ОА=
де ά - маса солоду у реакційному середовищі, мг;
0,05 і 0,0114 - сталі коефіцієнти, отримані експериментальним шляхом.
Приклад. На виготовлення солодової витяжки взято 10 г толочу у мірну колбу місткістю 100 мл. Одержану солодову витяжку потім розвели у 40 разів (5 мл в 200 мл розчину). Таким чином у реакцію введено 25 мг солоду. При поляризації фільтратів субстрату отримані показники ПК = 14,1 і ПД = 12,6.
Тоді ОА = (0,05·(14,1 -12,6)+ 0,0114)·1000/25 = 3,45 од./г.