4.3.4. Талассемии [31; 972; 138; 1253; 222; 97а]

Генетически детерминированное снижение или полное подавление синтеза той или иной цепи гемоглобина обусловливает ряд разнообразных патологических состояний, известных под общим названием «талассемии». Это слово происходит от греческого «Таласса» - Средиземное море, первоначально оно отражало средиземноморское происхождение большинства индивидов - носителей генов, ответственных за талассемию. Хотя с точки зрения географии или этнографии этот термин нельзя считать правильным, он используется достаточно широко. Все случаи талассемии можно под-

Таблица4.17. Мутации, приводящие к β-талассемии [972; 1253]
Локализация	Изменение в последовательности	Тип талассемии	Этническая группа
1. Мутации, нарушающие транскрипцию
а) удаленные регуляторные элементы
–87	C–G	β+	Жители Средиземноморья
–88	С–Т	β+	Негры США
б) ТАТА-последовательность
–28	А–С	β+	Курды
–28	A–G	β+	Китайцы
–29	A–G	β+	Негры США
2. Нарушения расщепления РНК на 1000 т. п. н. дальше экзона 3	Т–С	β+	Негры США
3. Неактивная РНК
а) нарушения терминации
кодон 17	А–Т	β°	Китайцы
кодон 39	С–T	β°	Жители Средиземноморья
кодон 15	G–A	β°	Индийцы
б) мутации сдвига рамки
кодон 8	–2	β °	Турки
кодон 16	–1	β °	Индийцы
кодон 44	–1	β °	Курды
кодон 8/9	+1	β °	Индийцы
кодон 41/42	–4	β °	Индийцы
кодон 6	–1	β °	Жители Средиземноморья
кодон 71/72	+ 1	β °	Китайцы
4. Мутации, затрагивающие процессинг РНК
а) границы сплайсинга
донорные участки
IVS-1, поз. 1	G–A	β °	Жители Средиземноморья
IVS-1, поз. 1	G–T	β °	Индийцы
IVS-2, поз. 1	G–A	β °	Жители Средиземноморья
IVS-1, поз. 5	G–C	β +	Индийцы
IVS-1, поз. 6	Т–С	β +	Жители Средиземноморья
акцепторные участки
1VS-1	деления 25 п. н.	β °	Индийцы
IVS-1	A–G	β °	Негры США
б) образование новых сайтов сплайсинга
новый донорный сайт
IVS-1,	С–T	β°	Китайцы
IVS-2, поз. 705	T–G	β+	Жители Средиземноморья
IVS-1, поз. 745	C–G	β+	»
1VS-1, поз. 116	T–G	β+	»
новый акцепторный сайт
IVS-1, поз. 110	G–A	β+	»
в) усиление криптических сайтов
кодон 24	Т–A	β+	Негры США
кодон 26	G–A	βЕ	Жители Азии
кодон 27	G–T	βKnossos	Жители Средиземноморья

90 4. Действие генов

разделить на α- и β-талассемии. Талассемии различаются по этиологии, поскольку показано, что ослабление синтеза цепей гемоглобина может быть обусловлено несколькими генетическими механизмами [1037].

Успехи в исследовании талассемий на молекулярном уровне привели к тому, что мутационные повреждения, характерные для этой группы заболеваний, изучены в настоящее время гораздо полнее любых других мутаций у млекопитающих. Изучение различных генов, ответственных за талассемию, позволило многое узнать о структуре, функции и организации глобиновых генов в норме. Выяснилось, что мутации, затрагивающие различные этапы синтеза гемоглобина, могут ослаблять синтез гемоглобина (β⁺-талассемий) или даже полностью его предотвращать (β⁰-талассемии) [972; 1253; 1238; 4341] (табл. 4.17, 4.18).

Транскрипционные или промоторные мутации. Мутации, которые вызывают талассемию и затрагивают 5'-некодирующую область гена Нbβ, можно рассматривать как регуляторые мутации, влияющие на транскрипцию. Такие мутации обнаружены в константном регуляторном элементе с последовательностью PuCPuCCC и внутри ТАТА-последовательности (табл. 4.17). Эти мутации ослабляют синтез гемоглобина и проявляются как относительно легкие формы талассемий. Мутации, затрагивающие СААТ-сайт, в настоящее время не обнаружены.

Мутации в сайте полиаденилирования РНК. У негров часто обнаруживается одиночная мутационная замена ААТААА  ААСААА в 3-фланкирующей области гена Нbβ, приводящая к β⁺-талассемий; таким образом, мутации в 3-некодирующей области также могут влиять на эффективность транскрипции. Относительно слабое проявление β-талассемий в этой расовой группе объясняется явным преобладанием мутаций, затрагивающих ТАТА-последовательность (см. выше) и сайт полиаденилирования (табл. 4.17).

Нонсенс-мутации и мутации со сдвигом рамки считывания. Как уже указывалось ранее, мутации, приводящие к возникновению терминирующего кодона внутри экзона гена гемоглобина, обусловливают синтез укороченной, неактивной цепи и вызывают поэтому β⁰-талассемию. Выявлены три такие мутации, одна из них характерна для уроженцев Средиземноморья (β³⁹С—Т). Обнаружена рестриктаза (Mael), узнающая

Рис. 4.52. Транскрипция и трансляция генов гемоглобина. Номера указывают сайты, которые изменяются при мутациях, вызывающих талассемию.

4. Действие генов 91

этот сайт, благодаря чему стала возможной пренатальная диагностика β³⁹-талассемии [1328а].

Делеции и инсерции, длина которых не кратна трем нуклеотидам, нарушают нормальное считывание генетической информации, в результате чего синтезируются нефункциональные цепи глобина. В различных популяциях обнаружено семь подобных мутаций, вызывающих β°-талассемию (табл. 4.17).

Мутации, нарушающие процессинг РНК. Процессинг РНК заключается в вырезании интронов и сплайсинге (сращивании) экзонов с образованием функциональной мРНК (рис. 4.40, 4.52). Описано много различных мутаций, нарушающих этот процесс. Например, известна целая группа мутаций, изменяющих динуклеотид GT (или AG) в донорном (или акцепторном) участке сплайсинга. Эти динуклеотиды входят в состав так называемых канонических (обобщенных) последовательностей, которые включают еще несколько нуклеотидов и играют центральную роль в нормальном сплайсинге. В результате одиночных замен в этих сайтах сплайсинг нарушается, что приводит к β°- или β⁺-талассемии. В некоторых случаях мутации активируют так называемые криптические сайты с динуклеотидами GT и AG. В норме, вероятно, эти сайты в сплайсинге не участвуют. В результате образование нормальной мРНК нарушается. Мутации в интронах могут генерировать новые сайты сплайсинга в интронах, которые конкурируют с нормальными сайтами, замедляя процессинг, и в конечном счете приводят к талассемии. Мутации другого класса усиливают уже существующие криптические сайты. Часто встречающаяся мутация такого типа НbЕ активирует такой сайт. Это приводит к ослаблению синтеза гемоглобина Hbβ^E и, следовательно, к талассемии. Различные мутации, нарушающие сплайсинг, перечислены в табл. 4.17. Все точковые мутации в гене β-глобина, которые вызывают β-талассемию, показаны на рис. 4.53.

Делеции в β-глобиновом кластере генов и наследственная персистенция фетального гемоглобина. В отличие от а-талассемии Р-талассемия обычно обусловлена не делениями генов. Однако из этого правила есть много исключений. Более трети случаев Р-талассемии у индийцев оказывается связанной с делецией длиной 619 п. н., которая начинается во втором интроне и заканчивается за 3'-концом некодирующей области гена Нbβ (рис. 4.54, табл. 4.18). Различные редкие делеции в этом гене описаны у негров США, известен один случай среди датчан. Обнаружено также несколько других, более крупных делеции в γ-δ-β-локусе. Их локализация и протяженность показаны на рис. 4.54. Методами цитогенетики эти делеции обнаружить не удается: они слишком малы для микроскопического изучения.

Мутации «гемоглобин Lepore» и «гемоглобин Kenya» представляют собой делеции, при которых сохраняются части функциональных генов и возникают их слияния: δ-β (гемоглобин Lepore) и γ-β (гемоглобин Kenya). Известно несколько делеции, при которых происходит утрата всего или почти всего кластера, при этом γ-, δ- и β-цепи не синтезируются. Принято различать делеции, приводящие к талассемическому фенотипу анемии, например δ-β-талассемия, и делеции, при которых отсутствие δ- и β-локусов компенсируется синтезом фетального гемоглобина (наследственная персистенция фетального гемоглобина, НПФГ). Это отличие не является абсолютным, поскольку при НПФГ компенсация благодаря синтезу γ-цепи не бывает полной. Остается

Рис. 4.53. Расположение мутаций, вызывающих р-талассемию в гене Нbβ. Различные мутации перечислены в таблице 4.17.

92 4. Действие генов

Рис. 4.54. Делеции в кластере генов γδβ. Большинство этих делеций встречается редко. НПФГ (англ. HPFH) - наследственная персистенция фетального гемоглобина.

неясным, почему некоторые делеции активируют ген фетального гемоглобина. В настоящее время этот вопрос интенсивно изучается.

Наследственная персистенция фетального гемоглобина может быть вызвана мутациями неделеционной природы. В случае греческой разновидности НПФГ обнаружена точковая мутация в 5'-фланкирующей области ^Аγ гена в положении —117 [1040]. Другая точковая мутация в положении 202 5'-фланкирующей области гена Hb^Gγ найдена у негров с неделеционной НПФГ [1093]. Считается, что последовательности, которые изменяются под действием этих мутаций, в норме играют ключевую роль в остановке синтеза у-цепи в постнатальный период.

Изучение генетического контроля синтеза гемоглобина имеет большое значение для лечения талассемии и серповидноклеточной анемии, так как усиленный синтез гемоглобина HbF при этих заболеваниях мог бы обеспечить значительный терапевтический эффект.

Гетероклеточная наследственная персистенция фетального гемоглобина [222]. Группа гетерогенных генетических состояний ха рактеризуется некоторым усилением синте за фетального гемоглобина (2-3%, иногд; более) и явно неравномерным распределе нием в популяции эритроцитов. Этим и

Таблица.4.18. β-талассемии, наиболее часто встречающиеся у различных этнических групп [972]
Этническая группа	Мутация, приводящая к β-талассемии	Тип	Частота, %
Негры США	ТАТА-последовательность (-29)	β+	39
	Сайт полиаденилирования	β+	26
Жители	Интрон 1 (поз 110)	β+	35
Средиземноморья	β39-терминатор	β+	27
Индийцы	Интрон 1 (поз. 5)	β+	36
	Делеция (619 п. н.)	β°	36
Китайцы	Сдвиг рамки (поз. 71/72)	β°	49
	Интрон 2 (поз. 654)	β°	38

4. Действие генов 93

объясняется название состояния - гетероклеточная НПФГ. Оно не сопровождается анемией. Если ген, определяющий гетероклеточную НПФГ, сочетается в генотипе с геном HbS или с геном β-талассемии, уровень фетального гемоглобина может превышать обычные 2-3%. В частности, при серповидноклеточной анемии повышенный уровень гемоглобина HbF приводит к смягчению клинической картины заболевания. Гетероклеточная НПФГ наследуется как доминантный аутосомный признак и, судя по рестрикционному картированию, не связана с заметными делециями в β-глобиновом кластере. Молекулярные основы гетероклеточной НПФГ неизвестны, но некоторые данные свидетельствуют о том, что геи, ответственный за повышенный уровень гемоглобина F, не сцеплен с γ-δ-β-кластером [1012].

Значение в клинике. β-Талассемии широко распространены в тропических и субтропических областях, поскольку больные, как оказалось, имеют некоторое селективное преимущество перед здоровыми в отношении тропической малярии [1227] (разд. 6.2.1.6). У гетерозигот по β-талассемии наблюдается небольшая анемия (табл. 4.19), несколько повышено количество гемоглобина А₂(α₂δ₂). Их эритроциты мельче и содержат меньше гемоглобина (показатели МСН и MCV снижены) [31; 222]. Гетерозиготы обычно не нуждаются в медицинском наблюдении или лечении. Внешний вид эритроцитов показан на рис. 4.55.

Гомозиготные больные с β-талассемией страдают сильной анемией и нуждаются в переливаниях крови. У гомозигот по β°-талассемии гемоглобин А полностью отсутствует, при β⁺-талассемии его уровень сильно снижен. Большая часть гемоглобина - это гемоглобин фетального типа. Заболевание характеризуется задержкой роста и приводит к летальному исходу в детстве или юности. Гомозиготы и гетерозиготы-компаунды по β⁺/β°-талассемии страдают тяжелой гемоглобинопатией. Показано, что одновременное поражение а-талассемией смягчает клиническую картину у гомозигот по р-талассемии.

Сочетание гемоглобина S с β⁺-талассемией характерно для негритянских популяций и по симптоматике напоминает серповидноклеточную анемию. Сочетание гемоглобина Е с р-талассемией часто встречается в Юго-Восточной Азии и, подобно β°-талассемии, вызывает тяжелую анемию. Это связано с тем, что мутация гемоглобина Е сама по себе приводит к легкой талассемии (см. выше).

К настоящему времени идентифицировано более 30 различных точковых мутаций, обусловливающих β-талассемию (рис. 4.53, табл. 4.17). Из них 33%-нонсенс-мутации и мутации со сдвигом рамки считывания - препятствуют трансляции мРНК, 47% нарушают сплайсинг, 16%-транскрипцию и 1 % - механизм полиаденилирования. По-видимому, известна лишь небольшая часть мутаций, вызывающих талассемию.

Удивительная гетерогенность мутаций в β-глобиновом локусе проявляется и в высокой частоте гетерозигот-компаундов по р-талассемии. Такие пациенты несут сразу две мутации, обусловливающие р-талассемию, и наследуют их от обоих родителей. В изолированных популяциях гетерозиготыкомпаунды встречаются несколько реже, поскольку большинство случаев заболевания в таких изолятах бывает связано с единичными, распространившимися мутациями. Например, нонсенс-мутация β³⁹ составляет приблизительно 27% всех мутаций, вызывающих р-талассемию в среднем по Средиземноморью (табл. 4.18), и в то же время составляет абсолютное большинство на острове Сардиния. Поскольку нарушения у гомозигот могут быть самыми разными (от едва заметных до полного отсутствия синтеза глобина) и гетерозиготыкомпаунды встречаются часто, тяжесть заболевания сильно варьирует. В табл. 4.19 приведены сведения о наиболее важных с клинической точки зрения гемоглобинопатиях.

α-Талассемии делеционной природы [1122, 1156а, 2322]. Большинство случаев α-талассемии связано с делециями генов. В ходе эволюции происходили конверсия генов (разд. 2.3.4) и множественные акты рекомбинации («согласованная эволюция»), что привело к высокой степени гомологии в

94 4. Действие генов

Таблица 4.19. Гемоглобинопатии, имеющие клиническое значение

структурных и фланкирующих областях нормальных генов α-глобинов. Гомология последовательностей в этих областях заставляет хромосомы неправильно спариваться, и при рекомбинации неидентичных спаренных хромосом возникают дупликации и делеции (рис. 4.56). Обнаружены хромосомы, содержащие только один ген (α) или три гена (ααα). Селекция на устойчивость к малярии привела к увеличению в тропических и субтропических популяциях частоты гена Нbα( — α). Это один из наиболее часто встречающихся типов талассемии. Хромосомы с утроенным локусом (ααα), по-видимому, практически не вызывают отрицательных эффектов у их носите-

4 Действие генов 95

Рис. 4.55. Мазки крови из периферических сосудов нормального человека (А) и больных гетерозиготного по β-талассемии (Б), гетерозиготного по α-thal-1 (В) и больного тяжелой формой β-талассемии (Г)

лей и встречаются в этих популяциях гораздо реже

Два типа делеций обусловливают умеренную форму α-талассемии (α-thal или — α /αα) Механизмы делеций проиллюстрированы на рис 4 56 При так называемом левостороннем кроссинговере возникает хромосома с одиночным геном Нbα вследствие ошибочного спаривания последовательностей, расположенных на 5'-конце aj-псевдогена, и гомологичной ей последовательности в локусе Hba₂ При рекомбинации происходит утрата участка ДНК длиной 4,7 т п н Поскольку область, в которой происходит рекомбинация в данном случае, расположена перед участком правосторонних делеций (см ниже), используется термин «левосторонний» Так называемый «правосторонний» кроссинговер, являющийся результатом неправильного спаривания между генами Hba₂ и Hbα_l, приводит к образованию комбинированного гена α₂-α₁ и делеций в 3,7 т п н Этот «правый» α-ген (точнее, ген α₁-α₁) – наиболее частая причина α-талассемии в Африке и в Средиземноморье, тогда как в Азии обнаруживаются продукты и левостороннего, и правостороннего кроссинговера Делеция одного гена α в обоих типах мутаций вызывает стертую форму талассемии и очень широко распространена во всем мире, причем частота гетерозигот достигает 33% в некоторых областях Африки и Средиземноморья

Делеций, обусловливающие утрату обоих α-локусов (– –), показаны на рис 4 57

Возникающая в этом случае талассемия часто обозначается как α-thal-1 Такие мутации распространены в Юго-Восточной Азии, редки в Средиземноморье и никогда не обнаруживаются у африканцев

Рис. 4.56. Кроссинговер в X и Z участках гомологии в области гена НЬа При «левостороннем» кроссинговере происходит ошибочное спаривание X участков гомологии с последующей рекомбинацией, при которой возникает один ген Нbα (с делецией длиной 4 2 т п н) При «правостороннем» кроссинговере происходит ошибочное спаривание Z гомологичных участков, кроссинговер внутри а-генов приводит к образованию составного гена α2α1 и делеции длиной 3,7 т.п.н В результате обоих событий возникают хромо сомы с тремя α-глобиновыми генами [1156а]

96 4. Действие генов

Рис. 4.57. Делеции в гене Hbα. Большая часть делеций встречается часто (см. текст). ■; ▥ протяженность делеций неизвестна.

Все делеции можно выявить как до, так и после рождения с помощью рестрикционного картирования. Описаны различные фенотипы, наблюдающиеся при делециях одного, двух, трех и четырех генов а (табл. 4.20, А, рис. 4.57). Отсутствие одного гена НЬа (— α/αα) не приводит к заметным гематологическим нарушениям, поскольку три остальных гена остаются активными. Для обнаружения талассемии при делеции одного из генов Нbα необходим рестрикционный анализ или количественный анализ биосинтеза α-цепи глобина. Делеция всех

четырех α генов (– –/– –) приводит к летальному исходу до или во время родов и известна под названием водянки плода, поскольку наблюдается сильный отек у мертворожденных детей. Большая часть молекул гемоглобина у таких детей состоит из четырех α-цепей (гемоглобин α⁴ или гемоглобин Bart). Считается, что плод способен доживать до поздних сроков беременности благодаря присутствию функционального гемоглобина Portland (ζ²у²). У африканцев водянка плода практически не встречается, это связано с отсутствием в популяции хромосом, несущих делецию обоих генов α-глобина.

Делеция двух генов α (– –/α+ или – –/сих) приводит к слабовыраженной анемии, тогда как делеция трех генов (—α/ — ) – к сильной анемии, для которой характерно образование гемоглобина НbН – тетрамера β⁴ (табл. 4.20, А). Гемоглобин НbН образуется вследствие недостатка α-глобина на фоне нормального синтеза β-глобина.

Неделеционная α-талассемия [972, 1156]. Логично предположить, что среди мутаций неделеционной природы имеются такие, которые обусловливают α-талассемию. Действительно, обнаружен широкий спектр таких мутаций (табл. 4.20, Б).

Таблица 4.20, А. α-Талассемии, обусловленные делециями
	Число генов Нbα				Общее число активных генов Нbα	Общее число делегиро­ванных генов Нbα
	материнских		Отцовских
	активных	делетиро-ванных	активных	делегиро­ванных
Норма	2	—	2	—	4	—
Слабовыраженная α-талас-семия	1	1	2	—	3	1
(α-thal-2)	2	—	1	1
Тяжелая α-талассемия	а) –	2	2	—
(α-thal-1)	б) 2	—	—	2	2	2
	в) 1	1	1	1
Болезнь
НbН	—	2	1	1	1	3
(НbН = Р4)	1	1	—	2
Водянка плода при Нbγ4	—	2	—	2	—	4
Следует отметить, что делеции могут быть унаследованы как от матери, так и от отца или (кроме мягкой формы а-талассемии) от обоих родителей. Кроме того, при различных комбинациях может возникать один и тот же фенотип тяжелой α-талассемии: а) мать: тяжелая α-thal, отец: норма; б) мать: норма; отец: тяжелая α-thal; б) отец: слабая α-thal, мать: слабая α-thal.

4. Действие генов 97

Таблица 4.20, Б. Мутации неделеционной природы, вызывающие α-талассемию [972; 1156]

Приведенный в таблице перечень не содержит регуляторных мутаций, локализующихся перед геном Нbα, однако найдена мутация, нарушающая стартовый кодон AUG. Фенотипически это изменение проявляется как α-талассемия – не образуется функциональной мРНК, поскольку AUGкодон, с которого начинается трансляция, находится в 32-м положении. Это приводит к синтезу явно дефектного α-глобина, лишенного первых 32 аминокислот. Известна также мутация в 3'-фланкирующей области, вызывающая снижение синтеза функциональной мРНК.

В настоящее время обнаружена лишь одна мутация, затрагивающая процесс

Рис. 4.58. Синтез цепей глобина при α-талассемиях. Синтез молекул глобина представлен в виде отношения Hbα/Hbβ, которое в норме близко к 1, другими словами, α- и β-глобин синтезируются в эквивалентных количествах. Носители, у которых признаки заболевания не выражены, являются гетерозиготами по α-thal-2 (стертая форма α-талассемии), это удается выявить только специальными биохимическими тестами [1159].

98 4 Действие генов

сплайсинга. Это короткая делеция длиной 5 п.н., удаляющая акцепторный сайт сплайсинга в первом интроне.

Известны четыре различные мутации, изменяющие терминирующий кодон UAA на смысловой. В результате этого образуется цепь α-глобина, удлиненная на 31 аминокислоту по сравнению с нормальной. мРНК, кодирующие такой удлиненный гемоглобин, нестабильны. В крови обнаруживается лишь до 5% мутантного белка. Наиболее часто из этих мутаций встречается гемоглобин Constant Spring (рис. 4.58).

В случае гемоглобина Quong-Sze мутация нарушает способность к образованию димера α₁β₁ и приводит к сильной нестабильности молекулы. Вероятно, будут обнаружены и другие варианты с подобными свойствами.

Прямых данных о частоте неделеционной α-талассемии нет, однако была изучена природа генов, аллельных генам а-талассемии, у больных с гемоглобином НbН (β⁴), у которых в одной из хромосом делетированы по меньшей мере два гена Нbα (—/αα). В популяциях Саудовской Аравии и Китая при гемоглобинопатии НbН до 50% таких аллельных генов а-талассемии не содержали делеций.