Определение активности фермента

Определить количественное содержание фермента в биологических объектах очень трудно, т.к. он присутствует в тканях в ничтожно малых концентрациях. Поэтому о количестве фермента судят по скорости катализируемой им реакции в стандартных условиях (t=25ºС, рН оптимальная, при полном насыщении фермента субстратом), и выражают в условных единицах.

За единицу активности фермента (Е- рус./нем. или U- англ./исп.) принимают такое количество фермента, которое в стандартных условиях катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в минуту (1 мкмоль/мин). Это стандартная международная единица выражения количества фермента и его активности введена в 1962 г. Международным биохимическим союзом.

В международной системе единиц Си (1972 г.) предложена, вместо старой безымянной единицы ферментативной активности (Е или U), новая единица ферментативной активности – катал. 1 катал – это количество фермента, обеспечивающее превращение 1 моля субстрата в 1 секунду в стандартных условиях. Т.к. реакции идут гораздо с меньшей скоростью, то активность выражают в микро-, нано- и пикокаталах. 1Е = 16,67 нкат.

Для характеристики активности ферментов на практике часто используют следующие понятия:

1. Удельная активность – это число единиц ферментативной активности в 1 мг фермента, т.е. число мкмолей субстрата, превращаемое в 1 мин 1 мг фермента. Уд. активность выражается также числом каталов на 1 кг фермента (кат/кг);

2. Молярная активность – выражается в каталах на 1 моль фермента;

3. Молекулярная активность – это число молекул субстрата, превращенное в 1 мин 1 молекулой фермента. Например, молекулярная активность каталазы = 5 мин;

4. Концентрация фермента – выражается в единицах ферментативной активности Е на 1 мл раствора.

Классификация ферментов

Современная классификация ферментов разработана в 1961 г. Комиссией по ферментам Международного биохимического союза. В основу классификации положен тип катализируемой реакции, которая является специфичным для каждого фермента.

Согласно этой классификации все ферменты делят на 6 главных классов:

1. Оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции;

2. Трансферазы – катализируют реакции межмолекулярного переноса групп атомов и радикалов;

3. гидролазы– катализируют реакции расщепления при участии воды;

4. лиазы – катализируют реакции внутримолекулярного негидролитического расщепления, с образованием двойной связи или присоединения по двойной связи;

5. изомеразы – катализируют реакции изомеризации;

6. лигазы (синтетазы) – катализируют реакции синтеза с затратой энергии.

1. Оксидоредуктазы – делятся на подклассы в зависимости от типа реакции окисления:

а). Дегидрогеназы – отнимают от субстрата 2 атома водорода в виде двух протонов и двух электронов. Делятся на аэробные и анаэробные дегидрогеназы.

• а эробные дегидрогеназы (оксидазы) передают отнятый водород на кислород с образованием воды или перекиси водорода:

H

S + 1/2O₂ S + H₂O

H

CH₂OH CH₂OH

O

O

O

ОH O₂ H₂O₂ H

OH

OH

H

H

Глюкозо

оксидаза

OH H OH

H OH H OH

Глюкоза глюколактон

• анаэробные дегидрогеназы (редуктазы) катализируют перенос атомарного водорода на промежуточный субстрат. В общем виде:

H H

S + S₁ S + S₁

H H

Все оксидоредуктазы – сложные ферменты. Непосредственными переносчиками водорода от субстрата являются коферменты дегидрогеназ. Большинство дегидрогеназ в качестве коферментов содержат НАД, НАДФ.

НАД НАДН₂

С

Лактатде-гидрогеназа

Н₃ – СН - СООН СН₃ – СН - СООН

ОН О

Молочная кислота ПВК (пировиноградная кислота)

в). оксигеназы – катализируют реакции, в ходе которых кислород включается в состав окисляемого субстрата.

Делятся на моно- и диоксигеназы:

• монооксигеназы (гидроксилазы) – включают в состав субстрата один атом молекулы кислорода, а второй восстанавливается до Н₂О. Донором Н₂ обычно является НАДФН₂.

НАДФН₂ НАДФ

S - H + O₂ S –OH + H₂O

• диоксигеназы – присоединяют к субстрату оба атома O₂

S + O₂ SO₂

г). пероксидаза и каталаза – гемсодержащие ферменты. Катализирующие реакции с участием Н₂O₂.

Простетическая группа имеет одно и тоже строение, содержит трехвалентное железо.

Пероксидаза окисляет органические соединения в организме с помощью O₂ или разлагает ее с выделением активного кислорода:

H

S + Н₂O₂ S + 2 H₂O

H

Н ₂O₂ H₂O + O

Каталаза разлагает Н₂O₂ на H₂O и молекулярный кислород:

2 Н₂O₂ 2 H₂O + O₂

д). цитохромы – система ферментов, катализирующих перенос электронов на молекулярный кислород:

O₂ + 4e 2О^2-

Цитохромы являются гемопротеинами и завершают все окислительные процессы в клетках.