МІНІСТЕРСТВО АГРАРНОЇ ПОЛІТИКИ УКРАЇНИ
ПОЛТАВСЬКА ДЕРЖАВНА АГРАРНА АКАДЕМІЯ
ФАКУЛЬТЕТ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ
КАФЕДРА ТЕРАПІЇ
ВИЗНАЧЕННЯ БІОХІМІЧНИХ ПОКАЗНИКІВ КРОВІ
Методичні вказівки до лабораторних занять з клінічної діагностики для студентів факультету ветеринарної медицини
ПОЛТАВА
ОТРИМАННЯ СИРОВАТКИ КРОВІ
Сироватка крові – це рідка частина крові без формених елементів та фібрину. Її отримують із нативної крові без використання антикоагулянту, що супроводжується утворенням кров’яного згустку. Зсідання крові пов’язане з перетворенням розчинного білка плазми (фібриногену) у нерозчинений білок – фібрин. При цьому, від молекули фібриногену за допомогою ферменту тромбіну відщеплюється чотири пептиди і утворюється фібрин, який полімеризується у вигляді довгих тонких ниток. Нитки фібрину утворюють сітку, в якій затримуються клітини крові.
Механізм зсідання крові складний. У цьому процесі беруть участь різні речовини, що містяться в плазмі і взаємодіють у результаті трьох основних реакцій, а саме – вихід в кров тромбокінази і утворення активного тромбопластину, перетворення під їх дією протромбіну у тромбін, який в свою чергу активує процес перетворення фібриногену у фібрин. Кожна цих з реакцій, каталізується відповідним ферментом. Процес отримання сироватки крові можна прискорити шляхом центрифугування нативної крові.
Для отримання сироватки кров беруть у чисту суху пробірку або інший посуд ставлять у тепле місце. Якщо рефракція не відбулася, тоді тонкою скляною паличкою (краще голкою для аортопункції) відділяють згусток від стінки пробірки. Рідку частину крові центрифугують при 3000 обертах протягом 10-15 хвилин.
Цей процес у лабораторії прискорюють відстоюванням нативної крові у термостаті при температурі 37-38оС протягом 1-2 годин, або центрифугуванням.
Для одержання плазми необхідно запобігати згортанню крові. З цією метою до неї додають антикоагулянти.
Плазма – це рідка частина крові, що звільнена від формених елементів. Її отримують шляхом центрифугування чи відстоювання стабілізованої крові. Отримання плазми крові пов’язане з необхідністю застосування антикоагулянтних речовин (приведених в таблиці).
Визначення каротину в сироватці крові і його клінічне значення
Простим і доступним методом визначення каротину в сироватці крові в умовах виробничої лабораторної практики вважається метод Кар – Прайса в модифікації Юдкіна.
РЕАКТИВИ: петролейний ефір або авіаційний бензин марки Б-70, 96% етиловий спирт, основний стандартний розчин двохромовокислого калію (360 г біхромату калію, дистильованої води до 500 мл), робочий розчин біхромату калію (змішують 2,4 мл основного розчину біхромату калію і 2,6 мл дистильованої води). Даний розчин по інтенсивності забарвлення відповідає 1 мг % концентрації каротину.
МЕТОДИКА ВИЗНАЧЕННЯ:
У центрифужну пробірку вносять: 1 мл сироватки (плазми) крові, 3 мл 96%-ного етилового спирту, перемішують скляною паличкою і центрифугують 10 хв при 3000 об/хв. Верхній шар етиловий спирт зливають, до осаду додають 5 мл ефіру (бензину), ретельно перемішують протягом 2 хв скляною паличкою і знову центрифугують 10 хв при 3000 об/хв. Ефір з екстракцією каротину зливають у градуйовану пробірку доводять ефіром до 5 мл і на ФЕКе при синьому світлофільтрі (довжина хвилі 400-500 нм) фотометрують у кюветі з товщиною робочого шару 1 см проти води. Паралельно фотометрують робочий стандартний розчин двохромовокислого калію.
Вміст каротину визначають за формулою :
Каротин
мг % =
де, Е досл. – екстинція дослідної проби,
Е станд.. – екстинція стандартного робочого розчину,
100– коефіцієнт для перерахунку, мг%.
При відсутності фотоелектроколориметра порівнюють забарвлення отриманого екстракту зі стандартною шкалою двохромовокислого калію
Записують номер пробірки і по шкалі знаходять якої кількості мг каротину відповідає забарвлення в дослідної пробірці.
Розрахунок по формулі :
Х
=
де, К – кількість мг каротину, знайденого при порівнянні випробуваної ефірної витяжки зі стандартом.
У – об’єм ефірного екстракту.
В – обсяг дослідної сироватки.
Кількість каротину в сироватці крові у різних видів здорових тварин: (мг/ 100 мл)
-
Велика рогата худоба
0,5-2,8
Вівці
0,0-0,02
Свині
0,0-0,01
Коней
0,02-0,2
Собаки
0,0-0,02
Кури
0,3-3,0
Каротин є основним джерелом вітаміну А. Він вміститься у рослинних кормах, молоці, молозиві, яєчному жовтку, печінці, риб’ячому жирі.
Гіпокаротинемія – зменшення кількості каротину в сироватці крові, спостерігається при дефіциті його в кормах, поганому засвоєнні його внаслідок хвороб шлунково-кишкового тракту, геноєтитах і гепсотозах, різних токсикозах.
Збільшення каротину зустрічається при цукровому діабеті.
Визначення кислотної ємності крові і її клінічне значення
Для визначення кислотної ємності існує багато методів. Їх можна розділити на дві групи: титрометричні і газометричні. Останні не знайшли широкого застосування в умовах виробництва через складність методик і використовуються в наукових лабораторіях. Титрометричні методи у своїй більшості засновані на модифікації класичного методу Неводова, що застосовується у ветеринарній практиці.
Титрометричний метод (по Неводову)
Принцип методу полягає в зв’язуванні лугів цільної крові з соляною кислотою, надлишок якої потім титрується до появи в розчині каламуть, що відповідає изоелектричної крапці білків крові.
РЕАКТИВИ : 0,01 н. розчин соляної кислоти, 0,1 н.розчин їдкого натрію, 0,1% спиртовий розчин фенолфталеїна (1г фенолфталеїна в 1 л 60 – 90%-ного етилового спирту).
МЕТОДИКА ВИЗНАЧЕННЯ:
У хімічний стаканчик ємністю 50-100 мл вносимо 10 мл 0,01 н. розчину HCL.
Сюди ж мікропіпеткою вносимо 0,2 мл крові.
Суміш збовтують і титрують 0,1 н. розчином NaOH до помутніння розчину (потім випадають пластівці), тобто до одержання изоелектричної суміші білків крові (альбумінів, глобулінів, гемоглобіну). Записують кількість витраченого на титрування їдкого натру.
Одночасно в інший стаканчик беремо 10 мл 0,01 н. розчину HCL і додаємо 2 краплі фенолфталеїну і титруємо 0,1 н. розчином їдкого натрію. Записуємо кількість лугу витраченого на титрування контролю. Цим установлюється титр розчину соляної кислоти.
Розрахунок проводять по формулі:
Х= ( а – в) * 20 * 100 , де
а – кількість мл лугу, витраченого на титрування контролю;
в – кількість лугу, витраченого на титрування досліду;
20 – коефіцієнт (1 мл 0,1 н. розчину лугу містить 0,04 мг NaOH , а 0,2 мл крові складає 1/500 частину у 100 мл крові, отже при збільшенні 0,04 у 500 разів одержуємо 20);
100 – коефіцієнт для перерахунку в мг/100 мл.
Деякі методи засновані на визначенні резервної лужності в сироватці крові з наступним перерахунком на цільну кров (за Беляєвим-Большаковим і ін.).
Метод за Беляєвим-Большаковим
РЕАКТИВИ: 0,01 н. розчин HCL
0,01 н. розчин NaOH
0,2% розчин метилового червоного (2 г розчиняють у 1л 60% -ного етилового спирту).
МЕТОДИКА ВИЗНАЧЕННЯ:
У хімічний стаканчик наливають 10 мл 0,01 н. розчину HCL, вносять 0,2 мл сироватки крові і додають 1-2 краплі індикатора (0,2% спиртового розчину метилрота). Вміст забарвлюється в інтенсивно рожевий колір. Ретельно перемішують і титрують із бюретки 0,01 н. розчином NaOH до переходу рожевого кольору рідини в жовтий.
Розрахунок проводять по формулі:
Кислотна ємність, мг% = (10-а) * 200, де
а – кількість 0,01 н. розчину NaOH, витраченого на титрування.
200 – постійна величина.
Показники кислотної ємності у сироватки здорових тварин (по Неводову): мг%
-
Велика рогата худоба
230 – 380
Вівці
230 – 320
Коні
270 – 400
Свіні
260 – 400
Собаки
220 – 340
Стабільність рН внутрішнього середовища організму забезпечується буферними системами крові (гидрокарбоннатної, фосфатної, гемоглобинової і білкової), а також функцією нирок, що виводять з організму продукти обміну речовин; легень, що виділяють надлишки вуглекислоти; травневого апарату; шкіри і молочної залози. На стан кислотно-лужної рівноваги впливають надходження й утворення в організмі як кислотних продуктів так і лужних речовин.
Зниження резервної лужності (кислотної ємності) крові свідчить про зрушення кислотно-основної рівновагі у бік ацидозу, а підвищення – алкалозу.
Метаболічний ацидоз зустрічається при одноманітному висококонцентратному або силосно – жомовому типі годівлі, кетозі, вторинній остеодистрофії, ацидозі рубця, цукровому діабеті, розладах травлення, особливо при діареї у молодняку, нефриті, нефрозі, септичних процесах.
Респіраторний ацидоз виникає внаслідок уповільнення процесу виділення вугільної кислоти легенями при розладах серцевої діяльності, емфіземі легень, при знаходженні тварин у середовищі з високою концентрацією у повітрі вуглекислоти.
Метаболічний алкалоз у тварин буває при алкалозі рубця, введенні в організм великих доз кухонної солі.
Респіраторний алкалоз – при гіпервентиляції легень, виведенні з організму великої кількості вуглекислого газу.