Лабораторная работа № 6 Определение α- глюкозидазной активности дрожжей.

Общие положения. В дрожжевой клетке содержится экзофермент β- фруктофуранозидаза. Способность дрожжей гидролизовать сахарозу β- фруктофуранозидазой, а затем сбраживать продукты ее гидролиза (глюкозу и фруктозу) называется зимазной актив-фруктофуранозидазой, а затем сбраживать продукты ее гидролиза (глюкозу и фруктозу) называется зимазнойактивостью. В дрожжевой клетке всегда присутствует β-фруктофуранозидаза, которая сосредоточивается, как правило, с внешней стороны ее мембраны. Благодаря этому гидролиз сахарозы происходит прежде, чем она проникнет в клетку. Зимазная активностьфермента проявляется с первых минут брожения.

α-Глюкозидазная активность свидетельствует о наличие фермента α- глюкозидазы, характеризующегося способностью гидролизовать мальтозу и сбраживать продукт ее гидролиза- глюкозу. α- Глюкозидаза играет большую роль в процессе приготовления хлеба. Она локализуется в цитоплазме дрожжевой клетки. Чтобы дрожжевая клетка могла использовать мальтозу, этот углевод должен проникнуть внутрь клетки и там гидролизоватьсяα-глюкозидазой до глюкозы.

Зимазная и α-глюкозидазная активность дрожжей выражается временем (мин), затраченным на выделение 10 см³ диоксида углерода при сбраживании раствора соответствующего сахара концентрацией 5 мас.%.

Цель работы: Освоить метод определения α- глюкозидазной активности дрожжей; оценить значения определяемого показателя для сбраживания пшеничных полуфабрикатов, содержащих заварку и не содержащих сахар- песок.

Аппаратура и материалы: Весы лабораторные квадратные 4-го класса точности ВЛКТ-500 с наибольшим пределом взвешивания до 500 г Цилиндр мерный вместимостью 10 см³; термометр стеклянный жидкостный с диапазоном измерения 0-50⁰С;

Реактивы: Фосфатный буферный раствор с рН 6,8; субстрат – 10%-ный раствор мальтозы; 30%-ный раствор сульфата цинка; 5М раствор соляной кислоты (430 см³ концентрированной соляной кислоты разбавляют дистиллированной водой до 1 дм³ в мерной колбе на 1 дм³); 15%-ный раствор гексацианоферрата калия.

Техника определения

10 г исследуемых дрожжей разводят в 200 см³ дистиллированной воды и 100 см³ фосфатного буферного раствора.

15 см³ раствора субстрата вливают в пробирку вместимостью 50 см³ и 10 мин выдерживают при 35ºС вультратермостате. Затем приливают 15 см³ исследуемой суспензии дрожжей, перемешивают и выдерживают при 35ºС в течение 60 мин.

Ферментативную реакцию останавливают добавлением 1 см³ 5М раствора соляной кислоты. После перемешивания к содержимому пробирки приливают по 1 см³ 30%-ного раствора сульфата цинка и 15%-ного раствора гексацианоферрата калия (2) для осаждения белков и осветления раствора. Смесь перемешивают фильтруют через бумажный складчатый фильтр.

Для приготовления контрольного раствора в пробирку вносят 15 см³ исследуемой суспензии дрожжей, приливают 1 см³ раствора соляной кислоты, а затем по 1 см³ растворов сульфата цинка и гексацианоферрата калия (2), смесь перемешивают и фильтруют.

Определяют угол вращения плоскости поляризации полученных фильтратов.

α-Глюкозидазную активность дрожжей (ед./г) рассчитывают по формуле:

МС = 0,0438 · ΔП · 10⁶ / (60·342·а) = 2,14 · ΔП / а, (5)

где 0,0438 – количество глюкозы, образующейся при гидролизе мальтозы в 1 см³ инкубационной смеси, соответствующей изменению угла вращения плоскости поляризации, равному 1º S,г;

ΔП – изменение угла вращения плоскости поляризации раствора по разности результатов контрольного и опытного растворов, ºS;

60 – продолжительность гидролиза, мин;

10⁶ – коэффициент перевода граммов в микрограммы;

342 – молекулярная масса мальтозы, г;

а – масса дрожжей в реакционной смеси, г.

Масса дрожжей в реакционной среде:

а = 10 · 15 / 300 = 0,5 г.

Вопросы для самоконтроля :

1.В чем выражается зимазная и α-глюкозидазная активность?

2. Что называется зимазной активностью?

Заключение: Дать оценку α- глюкозидазной активности дрожжей.

Лабораторная работа №7