Практическая часть Опыт №1 .Распределительная хроматография аминокислот (нисходящая хроматография).

При нисходящей хроматографии полоски хроматографической бумаги, с нанесенным раствором разделяемой смеси погружают в ванночку с растворителем, находящуюся в верхней части герметически закрывающейся хроматографической камеры. Полоска бумаги при этом свободно свисает из

ванночки, и растворитель по ней движется сверху вниз.

Ход определения. Готовят смесь из нескольких аминокислот, имеющих разные коэффициенты распределения. Можно впять следующие сочетания

аминокислот:

а) глицин - 22,7 мг, валин - 11,7 мг, гистидин солянокислый - 22,7 мг, изо лейцин - 13,1 мг;

б) аргинин солянокислый - 21,0 мг, глутаминовая кислота - 14,7 мг, аланин - 8,9 мг, метионин 14,9 мг;

в) лизин солянокислый - 18,1 мг, серии - 10,5 мг, тирозин - 9 мг, фенила ланин -15,1 мг;

г) цистин - 23,8 мг, аспаргиновая кислота - 13,3 мг, треонин ^11,9 мг, триптофан - 20,4 мг,

д) глутаминовая кислота - 14,7 мг, глицин - 7,5 мг, треонин - 11,9 мг,

Для приготавления раствора одну из смесей растворяют в 10 мг 50%~ кого раствора муравьиной кислоты или в 10 мг дистиллированной воды, к которой добавляют несколько капель бутилового спирта

Чтобы приготовить растворитель берут 4 части бутилового спирта, одну" часть ледяной уксусной кислоты и 5 частей дистиллированной волы жидкости наливают в делительную воронку, встряхивают в течение нескольких минут и оставляет для разделения слоев. Нижний о лей сливают и используют для насыщения его парами камеры, в которой производится хроматография. Верхний насыщенный водой бутилово-уксусный слой, используют для хроматографии.

На дно хроматографической камеры наливают небольшое количество растворителя, который при испарении насыщает камеру парами, что предотвращает высыхание фильтровальной бумаги. В верхней части камера укрепляют ванночку, представляющей собой стеклянную трубку соответствующую длине камеры, запаянную с концов, имеющую продольный разрез шириной 2-3 мм, и наливают в нее растворитель.

Берут полоску хрономатографическоЙ бумаги шириной 5 см и, отступая от ее края на 8-10 см, при помощи микропипетки наносят 0,005-0,01 мл приготовленной смеси аминокислот. Образовавшееся пятно быстро просушивают над электроплиткой Коней бумаги, ближе к которому нанесена капля смеси, опускают в ванночку с растворителем, а второй конец должен свободно свисать через отверстие в ванночке в камеру. Необходимо следить, чтобы полоска бумаги свисала строго вертикально и не прикасалась свободной концом ни к стенкам, ни ко дну камеры, ни к растворителю на дне камеры. В ванночке полоса бумаги фиксируется предметным стеклом или стеклянной палочкой.

В процессе хроматографии растворитель должен пройти вдоль всей полосы бумаги, увлекая за собой аминокислоты. Когда растворитель пройдет до конца полосы, ее извлекают из камеры и высушивают на воздухе в вытяжном шкафу Для лучшего разделения смеси пропускание растворителя можно повторить. Высушенную полосу опрыскивают раствором 0,5%-ного нингидрина на ацетоне с добавлением уксусной кислоты и воды (95:1:4) и помещают в сушильный шкаф при температуре 60 °С на 10-15 чин. На высушенной полосе появляются отдельные лиловые пятна, соответствующие адсорбированныз аминокислот из взятой смеси.