Фиксация и хранение паразитов

Перед фиксацией всех собранных паразитов (кроме нематод) хорошо отмывают в воде. Фиксируют всех паразитов живыми, но перед фиксацией некоторое время выдерживают в воде, чтобы ослабилась мускулатура. Самым простым и удобным средством фиксации и хранения большинства паразитов с целью их дальнейшего определения и изучения является 60–75-градусный спирт (не пригоден для фиксации метацеркарий). Ленточных червей фиксируют в просторной посуде (чашка Петри) для предотвращения их спутывания в клубок. Чтобы зафиксировать крупных плоских червей (ленточных и терматод), их в расправленном состоянии их кладут на помещенное на дно чашки Петри стекло, наливают небольшое количество воды и накрывают сверху вторым предметным стеклом, иногда с добавочным грузиком, после чего сбоку пипеткой подпускают спирт, несколько больше, чем 70 крепости. Зафиксированные таким образом черви, хранятся в 70-градусном спирте. Скребней фиксируют также в 70-градусном спирте, но более длительно (не менее 2 часов). Для того чтобы хоботок у них был вывернут, применяют способ осторожного, но достаточно сильного, сдавливания червей между стеклами, иногда с грузиком (под бинокуляром). Толстые экземпляры следует накалывать тонкими иглами в 2-3 местах. Круглых червей фиксируют подогретым фиксатором и хранят в жидкости Барбагалло (3-процентный раствор формалина в физиологическом растворе). Это предохраняет нематод от сморщивания и деформации, что случается при хранении их в спирте. Пиявок фиксируют 1–2-процентный раствором формалина, который сохраняет форму и пигментацию тела. Паразитических рачков и глохидий фиксируют 70-градусным спиртом и сохраняют также в 70–75-градусном спирте. Моногеней не фиксируют, а прямо заключают в глицерин-желатин. Высших моногеней фиксируют 70-градусным спиртом в живом состоянии придавленных покровным или предметным стеклом с последующим хранением в 70-градусном спирте.

При фиксации паразитов важно соблюдать следующие условия:

1) объем фиксирующей жидкости должен в несколько десятков раз превышать объем фиксируемых объектов;

2) фиксатор не приливают постепенно, а объект переносится в фиксатор.

Зафиксированных паразитов кладут в пробирку, наполненную до краев 70-градусным спиртом, вкладывают туда же этикетку, написанную твердым карандашом на пергаментной бумаге, и затыкают плотным комочком ваты, обязательно смоченным в спирте. В этой пробирке не должно образоваться воздушного пространства. Этикетка должна быть обращена надписью к стеклу, чтобы, взяв пробирку, можно было увидеть номер вскрытия и другие данные.

П ри помощи пинцета такие пробирки с материалом опускают стоймя в материальную банку с 70-градус­ным спиртом, на дно которой положен небольшой слой ваты. В материальную банку надписью к стеклу вкладывается общая этикетка с обозначением места и времени сбора. В таком виде материал можно достаточно долго хранить до обработки (рис. 6).

Окраска паразитов и изготовление препаратов

Мазки крови (сухие) окрашиваются по методу Романовского. Раствор краски перед употреблением разводят дистиллированной водой (1-2 капли на 1 см³ воды) и пипеткой наливают на горизонтально расположенные препараты на 30-40 минут при фиксации метиловым спиртом и на 1-1,5 часа при другой фиксации. Препараты держат в краске мазком вниз во избежание загрязнения его выпадающим осадком. Затем стекла споласкивают дистиллированной водой, высушивают. Микроскопируют с иммерсией, увеличение объектива 90.

Миксоспоридии можно определять и не окрашивать в капле воды или спирта. При необходимости изготавливают глицерин-желатиновые препараты из живых споровиков. Для приготовления такого препарата на предметном стекле расплавляют кусочек глицерин-желатина и в образовавшуюся каплю вносят разорванную цисту или ее часть. Тщательно размешивают и укрывают покровным стеклом. Зрелые споры при этом не меняют своих размеров, однако происходит сильное просветление спор и детали их строения становятся менее заметными. Этот недостаток полностью устраняется при использовании фазово-контрастной микроскопии.

Для фиксации инфузорий изготавливают сухие мазки. Для этого на чистое покровное стекло кладется капля соскоба, которая плотно прикрывается и прижимается сверху другим покровным стеклом того же размера. После того как содержимое между стеклами расплющится, одно стекло сдвигается с другого. На каждом из стекол получается по тонкому мазку. Не допуская подсыхания, покровное стекло опускают мазком вниз в раствор Шаудина на 15-20 минут для фиксации (мазок плотно прилипает к стеклу). Затем стекло промывают в 70-градусном спирте и опускают на 10-15 минут в слабый раствор йода (цвета слабого чая) для отмывки сулемы. Снова промывают в 70-градусном спирте, подсушивают на воздухе и хранят в стеклянных цилиндрах до последующей обработки. Стекла с мазками кладут друг на друга мазками в разные стороны и отделяют от следующей пары кольцеобразной прокладкой из плотной бумаги и кружками-этикетками из кальки, на которых пишутся сведения о хозяине, локализации, месте и дате сбора. Затем мазки серебрят по методу Клейна (серебрить по Клейну можно сухие нефиксированные мазки, которые до обработки сохраняются в течение месяца).

Моногеней без предварительной фиксации и окраски заключают в глицерин-желатин. Для этого 2-3 особи кладут с каплей воды на предметное стекло, отсасывают избыток воды, дают подсохнуть ее остатку на стекле, не допуская слипания червей (их можно осторожно раздвинуть иглами). Чистым скальпелем берут кусочек глицерин-желатина, растапливают его и опускают каплю на стекло, покрыв ею червей. Затем осторожно опускают на густеющую каплю чистое покровное стекло. После этого под контролем бинокуляра придавливают иглой покровное стекло пока хитиноидные образования у сплющенных червей не станут хорошо видны. Края покровного стекла обводят рамкой из канифольной замазки. Это можно сделать не сразу, а через несколько месяцев.

Крупных моногеней, диплозоонов можно фиксировать 70-градусным спиртом и сразу после фиксации красить квасцовым кармином (смотри окраску трематод).

Фиксированных 70-градусным спиртом трематод, ленточных червей и скребней лучше всего окрашивать водным раствором квасцового кармина. Перед окраской червей выдерживают в воде несколько часов для удаления из тканей остатков фиксатора (можно оставить на ночь). Затем переносят в кармин, причем срок окраски зависит от возраста краски и давности фиксации червей. После окраски черви (они должны быть интенсивно малинового цвета) промываются водой и дифференцируются 70-градусным подкисленным спиртом под контролем бинокуляра. При дифференцировке паренхима червей светлеет до светло-розового цвета, и на ее фоне четко видны внутренние органы. Окрашивание и дифференцировку ведут в солонках или глубоких часовых стеклах.

Данные о строении метацеркарий стригеид можно получить при параллельном изучении и фиксированных, и живых червей. Изучение живых метацеркарий производят, помещая их в воду, где инцистированные личинки могут прожить несколько суток. Метацеркарии бывают заключены в капсулы с толстыми стенками, и при извлечении их оттуда они часто бывают повреждены. Чтобы этого не происходило, применяют препаровальные иглы, сделанные самим исследователем из швейных игл первых номеров. Удобны иглы «наоборот», т.е. воткнутые острием в ручку и с расплющенным (молотком) ушком. Такая «лопаточка» изгибается под прямым углом. Для освобождения личинки ее капсулу прижимают лопаточкой, а иглой осторожно разрывают оболочку и пипеткой помогают личинке выйти из капсулы. На живом материале выявляют структуру оболочек цисты, строение органа Брандеса, положение и форму псевдоприсосок, элементы выделительной системы, т.е. систематические признаки. Для фиксации метацеркарий стригеид используют как свободные, так и инцистированные личинки. Для этого фиксацию проводят в уксуснокислом кармине, который является одновременно и фиксатором, и красителем. При окраске следят, чтобы как можно меньше воды попало в краску. После окрашивания объекты дифференцируются в подкисленном спирте. Затем личинки проводят через спирты возрастающей крепости и изготавливают препараты на основе канадского бальзама (бальзам можно заменить цилоидином).

При сборе личинок диплостоматид (извлекают из глаз рыбы) их отмывают в воде и оставляют на 2-3 часа в речной или водопроводной воде. За это время не достигшие инвазионной стадии личинки гибнут, а оставшихся в живых вместе с минимальным количеством воды переносят в раствор уксуснокислого кармина на 5-10 минут. Затем помещают в 70-градусный подкисленный спирт для дифференцировки и последовательно проводят через спирты возрастающей крепости (80, 85, 90, 96). Все эти манипуляции проводят в мелких пробирках укрепленных в подставке (пенопласт, поролон). Смену жидкостей осуществляют путем отсасывания старой и добавления новой, не вынимая объекты из пробирки. После этого в 96-градусный спирт с диплостоматидами добавляется по стенке пробирки диметилфталат. При этом личинка оказывается на границе спирта и более тяжелого диметилфталата. Пропитавшись последним, она опускается на дно пробирки и готова для приготовления постоянного препарата в канадском бальзаме. Если почему-либо нельзя изготовить постоянный препарат сразу, то метацеркарий можно оставить в 80-градусном спирте, либо диметилфталате, где они хранятся длительное время. Скребней рекомендуется перед окраской проколоть в двух местах, но они так же, как и другие черви, могут быть исследованы без окраски в концентрированном растворе молочной кислоты.

Круглых червей не окрашивают, так как их толстая кутикула краску не пропускает. Их просветляют до полной прозрачности в глицерине или молочной кислоте, перенося туда из 70-градусного спирта или формалина. Мелкие черви просветляются очень быстро, крупные в течение 2-3 суток. Затем из нематод при сильном придавливании можно делать глицерин-желатиновые препараты.

Паразитических ракообразных исследуют в спирте или глицерине без предварительной окраски.

Личинки моллюсков – глохидии снимают с рыбы, хорошо отмывают в воде, кладут в солонку с водой, держат до двух суток, дважды в сутки меняя воду. Глохидии раскрываются, и из них можно делать глицерин-желатиновые препараты на ножках.