4.6. Абсорбційна й диференційна спектрофометрія

Спектр поглинання білка в УФ-ділянці (230–310 нм) зумовлено поглинанням ароматичних амінокислот – триптофану, тирозину й фенілаланіну. Світло поглинають хромофорні групи цих амінокислот: індольне кільце у триптофані, фенольне кільце в тирозині й бензольне – у фенілаланіні.

Основним законом абсорбційної спектрофотометрії є закон Ламберта–Бера:

(4.9)

де І – інтенсивність світла, яке пройшло через розчин досліджуваної речовини; І_о – інтенсивність світла, яке падає на кювету; n – кількість молекул в одиниці об’єму; k – ефективна площа поперечного розрізу сечение переріз молекули, яка поглинає кванти світла; l – товщина кювети. Частіше використовується запис цього закону через десяткові логарифми:

(4.10)

де с – концентрація розчину, моль л^-1;  – коефіцієнт молярної екстинції, моль^-1  м^-1. Закон Ламберта–Бера в логарифмічній формі записується таким чином:

D = lc, (4.11)

де D – оптична густина розчину. Оптична густина

,

де Т – оптичне пропускання розчину. Оптичне пропускання вимірюють як .

Залежність D чи  від довжини хвилі  світла називається спектром поглинання: D = f() чи  = f(). Залежність Т = f() називається спектром пропускання речовини. Спектральні прилади, на яких вимірюють спектри поглинання або спектри пропускання речовини, називаються спектрофотометрами. На рис. 4.11 зображено блок-схему двопроменевого спектрофотометра.

Рис. 4.11. Блок-схема спектрофотометра: 1 – джерело світла; 2 – лінза; 3 – монохроматор; 4 – напівпрозоре дзеркало; 5 – відбиваючі дзеркала; 6 і 7 – кювети з розчином і розчинником, відповідно; 8 – призма; 9 – ФЕП; 10 – підсилювач; 11 – записуючий пристрій

Спектр поглинання триптофану (рис. 4.12, а) має максимум _max = 280 нм і незначний пік 290 нм. Коефіцієнт молярної екстинції ₂₈₀ = 5,6  10⁵ моль^-1  м^-1. Максимум спектра поглинання тирозину _max= 275 нм і ₂₇₅ = 1,25  10⁵ моль^-1  м^-1. Слабе поглинання має фенілаланін _max = 257,5 нм і _275,5 = 0,19  10⁵ моль^-1  м^-1. Отже, характерна смуга поглинання білка з _max = 280 нм становить суму спектрів поглинання триптофанових, тирозинових і фенілаланінових залишків: .

Рис.4.12. Спектр поглинання (а) і температурно-пертурбаційний диференційний спектр (б) триптофану у воді (рН = 7,0); градієнт температури Т = 10⁰; D – диференційна оптична густина

За конформаційних змін білкових молекул відбуваються невеликі зміщення спектра поглинання (менше 1 нм), які важко реєструвати на спектрофотометрі. Для підвищення чутливості методу використовується диференційна спектрофотометрія. У цьому методі в кювету порівняння заливається не розчинник (буфер), а розчин білка, і тоді на приладі реєструється диференційний спектр як різниця між спектром поглинання білка у вимірювальній кюветі та спектром поглинання білка в кюветі порівняння. Якщо білок у вимірювальній кюветі не змінює конформацію при дії фізичних (зміна температури) чи хімічних (зміна рН, іонної сили) факторів, то прилад реєструє нульову або базову лінію. Якщо спектр поглинання в кюветі порівняння є D(), а при дії певного фактора у вимірювальній кюветі відбувається зміщення спектра на , і спектр становитиме D( + ), то диференційний спектр буде різницею цих двох спектрів

D() = D( + ) – D(). (4.12)

Якщо розкласти (4.12) в ряд за малим параметром  і знехтувати членами другого порядку і вище, то

D()  . (4.13)

У першому наближенні диференційний спектр відповідає першій похідні від спектра поглинання. Отже, замість невеликих спектральних зсувів зміщень , які важко реєструються, точно вимірюється величина диференційного поглинання D() на чутливих диференційних спектрофотометрах. На рис. 4.12, б зображено диференційний спектр поглинання триптофану. Характерним піком у цьому спектрі для триптофану, за яким проводиться аналіз доступних хромофорів у білку, є пік 293 нм; для тирозину – 286 нм, для фенілаланіну – кілька піків 268,8; 265,5; 259,5 і 253 нм.

Методи абсорбційної й диференційної спектрофотометрії широко використовуються для визначення констант рівноваги дисоціації комплексів білок–ліганд, постійних швидкостей асоціації субодиниць у складних білках, процеси денатурації й ренатурації білків тощо. Конформаційний стан білкової глобули оцінюється за диференційною спектрофотометрією через визначення доступних хромофорних груп (триптофанілів чи тирозилів) до зовнішніх пертурбантів. Використовуються два методи диференційної спектрофотометрії.

А. Сольвентно-пертурбаційна диференційна спектрофотометрія. При додаванні до розчину білка 20 % пертурбанту (пертурбанти  метанол з ефективним розміром молекули d = 0,28 нм; етиленгліколь (d = 0,44 нм); гліцерин (d = 0,52 нм); глюкоза (d = 0,72 нм); сахароза (d = 0,94 нм)) незначно змінюються оптичні властивості хромофорів, що супроводжується невеликим зміщенням спектра поглинання. Якщо кювету порівняння заповнити розчином білка, а вимірювальну кювету – розчином білка такої самої концентрації з 20 % пертурбанту, то на спектрофотометрі реєструватиметься сольвентно-пертурбаційний диференційний спектр (СПДС). У цьому методі використовуються ще дві тандемні кювети для компенсації додаткового поглинання доданим пертурбантом. Кількість хромофорів у білку (а – триптофанилів, в – тирозилів), на які діє пертурбант, визначається за методом Т. Гершковича і М. Соренсона (1968):

^б₂₉₃ = а  ^Трп₂₉₃ + в  ^Тир₂₉₃;

^б₂₈₆ = а  ^Трп₂₈₆ + в  ^Тир₂₈₆ , (4.14)

де ^б₂₉₃ і ^б₂₈₆ – диференційні коефіцієнти молярної екстинції білка на 293 (характерний пік у диференційному спектрі триптофану, рис. 12, б) і 286 нм (для тирозину); ^Трп і ^Тир – диференційні коефіцієнти молярної екстинції триптофану й тирозину, які визначаються незалежно в модельних експериментах.

Б. Температурно-пертурбаційна диференційна спектрофотометрія. Розчин білка одинакової концентрації заливається у дві кварцеві кювети, які розміщуються в комірках, через які пропускається вода від термостатів. При створенні різниці температур у двох кюветах реєструється характерний температурно-пертурбаційний диференційний спектр (ТПДС), який являє собою внесок диференційного поглинання триптофанових, тирозинових і фенілалінінових залишків, які під дією температури змінили свої спектральні характеристики. Кожен із хромофорів має свій характерний ТПДС. На рис. 4.12, б наведно ТПДС триптофану, коли в кюветах створюється різниця температур 10⁰ С. ТПДС триптофану, тирозину й фенілаланіну мають характерні піки, дуже близькі за положенням до таких у СПДС.

Рис. 4.13. Температурно-пертурбаційні диференційні спектри:

а – хімотрипсиногену А у фосфатному буфері (0,05 моль/л, рН = 6,8); б – сироваткового альбуміну бика в КСl (0,25 моль/л, рН = 6,75); 1 – ТПДС досліджуваних білків; 2 – ТПДС розчинів N-Ac-Tyr-Oe i N-Ac-Trp-NH₂ у молярних співвідношеннях, які відповідають Tyr/Trp у даних білках (а – 4 : 8; б – 18 : 2); D₂₈₀ =1,0; градієнт температури в кюветах 15⁰С

Паспортною характеристикою хромофору, яка визначається з ТПДС, є температурний інкремент екстинції () (О. Демченко, В. Зима, 1974):

() = , (4.15)

де D() – диференційна оптична густина у ТПДС; D_max – оптична густина розчину хромофору в максимумі спектра поглинання (для білка 280 нм); t – різниця температур у кюветах. Для триптофану ₂₉₃ = 1,1  10^-3 град^-1; для тирозину ₂₈₇ = 2,12  10^-3 град^-1; для фенілаланіну ₂₆₅ = 3,09  10^-3 град^-1. Частка температурно-пертурбованих хромофорів а (зокрема, триптофанілів) у білку визначається як відношення температурного інкременту екстинції білка _^б до температурного інкременту екстинції хромофору _^м

а = . (4.16)

ТПДС різних білків значно відрізняються один від одного на відміну від звичайних спектрів поглинання цих білків. На рис. 4.13 наведено ТПДС хімотрипсиногену А і сироваткового альбуміну бика.