4.2. Дисперсія оптичного обертання (доо) і круговий дихроїзм (кд)

Ці оптичні методи широко використовуються для дослідження вторинної структури білків. В їх основі лежить фізичне явище – взаємодія лінійно поляризованого світла з оптично активними молекулами. Амінокислоти мають асиметричні атоми вуглецю, які викликають появу оптичної активності. Спектри ДОО і КД реєструються в ділянці поглинання пептидних груп (ультрафіолетова ділянка спектра 180–230 нм). Це поглинання зумовлено двома електронними переходами: інтенсивного π  π-переходу за 190 нм з коефіцієнтом молярної екстинції _max  7  10⁵ моль^-1  м^-1 і слабкого nπ-переходу за 210 нм (_max  10⁴ моль^-1  м^-1).

Дисперсія оптичного обертання (ДОО) Розглянемо взаємодію оптично активної речовини з лінійно поляризованим світлом, яке становить суму двох циркулярно поляризованих хвиль з лівообертальною (L) і правообертальною (R) поляризацією. Оптично активна речовина характеризується різними показниками заломлення n_L i n_R для L- i R-компонентів світла, завдяки чому відбувається обертання площини поляризації на певний кут. Кут обертання  (у градусах) буде пропорційний різниці n_L – n_R і товщині шару d (товщина кювети) оптично активної речовини:

. (4.1)

Питоме обертання розчину концентрацією речовини с [г  см^-3] і товщиною d (дм) розраховується за формулою:

град  см³/г  дмоль (4.2)

Молярне обертання

, (4. 3)

де М – молекулярна маса речовини. Кут обертання _ залежить від довжини хвилі  світла, яке поглинається оптично активною речовиною. Залежність []_ або [M]_ від  називається дисперсією оптичного обертання (ДОО). Спектральні прилади, які з високою точністю реєструють ДОО, називаються спектрополяриметрами.

У максимумі ₀ смуги поглинання речовини ДОО стає аномальним, набуваючи нульового значення (ефект Коттона). За ділянкою смуги поглинання ДОО плавно змінюється залежно від , підкоряючись рівнянню Друде:

, (4.4)

де К – стала. Залежно від форми ДОО можливі два ефекти Коттона. Якщо за   ₀ величина [М]_ має додатні значення, це позитивний Коттон-ефект, якщо від'ємного – негативний Коттон-ефект (рис. 4.5).

Рис. 4.5. Ефект Коттона у смузі поглинання:

а – смуга поглинання речовини D; б – ДОО; в – КД; (+) – позитивний Коттон-ефект; (-) – негативний Коттон-ефект.

Коли біомакромолекули містять спіральну упорядкованість, тоді ДОО апроксимується рівнянням Моффіта:

,

де а₀ – стала; через b₀ визначається ступінь спіральності, коли експериментальні дані відображаються на графіку Моффіта–Янга: [М]_[(² – ₀²)/₀²] = f [₀²/(² – ₀²)].

Круговий дихроїзм (КД). Оптично активна речовина по-різному поглинає L- і R-компоненти світла і тому має різні коефіцієнти молярної екстинції _L i _R. Як результат різної оптичної густини D для L- i R-компонент лінійно поляризоване світло після проходження розчину оптично активної речовини перетворюється на еліптично поляризоване світло. Вимірюється еліптичність  речовини:

, (4.5)

де D_L i D_R – оптична густина для L- i R-компонент відповідно.

Молярна еліптичність становитиме:

. (4.6)

Залежність []_ від  називається спектром КД. Прилад, на якому реєструють спектри КД, називається дихрографом.

Метод КД широко використовується для дослідження вторинної структури білків. Головна перевага цього методу полягає в тому, що він дозволяє отримувати добре розділені спектри для -спіралі, -структури й неупорядкованої форми. На рис. 4.6 зображено спрощену блок-схему дихрографа.

Рис. 4.6. Блок-схема дихрографа:

1 – джерело УФ-світла; 2 – монохроматор; 3 – поляризатор; 4 – кристал, який пропускає почергово L- чи R-компоненту; 5 – модулятор; 6 – кювета з оптично активною речовиною; 7 – фотоелектронний помножувач (ФЕП); 8 – електронна система реєстрації спектрів КД

Для дослідження вторинної структури білків використовується такий емпіричний підхід. Вимірюються спектри КД модельних поліпептидів, які перебувають в одній з конформацій – -спіраль, -структура чи неупорядкований клубок. Правдивість такої конформації точно встановлено завдяки рентгеноструктурному аналізу. На дихрографі отримують три контрольні спектри КД для -спіралі, -структури і клубка (рис. 4.7, а).

Основні характеристики спектрів: чому квадратні скобки?

[] в одиниці вимірювання?

_max = 190 нм, = + 71000

-спіраль _min = 206 нм, [] = - 36000

_min = 222 нм, [] = - 3800

_max = 195 нм, [] = + 35000

-структура _min = 215 нм, [] = –20000

клубок _min = 197 нм, [] = –25000

Рис. 4.7. Конформаційні зміни полі-L-лізину:

а – спектри КД трьох конформацій: 1 - -спіраль (рН = 12; 295 К);

2 - -структура (рН = 12, нагрівання до 325 К і потім охолодження до 295 К);

3 – неупорядкований клубок (рН = 5,7; 295 К); б – перехід клубок – спіраль за зміни рН

У першому наближенні білкову молекулу розглядають як лінійну комбінацію конформацій -спіралі, -структури і клубка. Якщо позначити вміст цих конформацій як n_, n_, n_к, і n_ + n_ + n_к = 1, то для досліджуваного білка

[]_ = n_[_]_ + n_[_]_ + n_к[_k]_, (4.7)

де [_]_,[_]_ і [_k]_ – молярні еліптичності для кожної з конформацій, які беруться з контрольних спектрів на фіксованій . Оскільки контрольні спектри значно відрізняються (рис. 4.7, а), то можна вдало вибрати три спектральні ділянки ₁, ₂ і ₃, для яких записуються три лінійні рівняння типу (4.7), розв’язок яких дозволяє знайти n_, n_, i n_к.

За допомогою методів ДОО і КД встановлено, що білки значно відрізняються за кількістю упорядкованих структур. Фібрилярні білки є високо упорядкованими (наприклад, тропоміозин має 93 % -спіралей). Глобулярні білки є менш упорядкованими – в лізоцимі 45 % -спіралей, 20 % -структур і 35 % неупорядкованих структур; у хімотрипсині 14 % -спіралей, 45 % -структур і 41 % неупорядкованих структур.

Зміна температури, рН, додавання в розчин таких денатуруючих речовин, як сечовина, хлорид гуанідину викликають перехід поліпептидного ланцюга від упорядкованої конформації (-спіраль, -структура) до неупорядкованої структури. Переходи спіраль – клубок добре вивчено на простих модельних поліпептидах. Полі-L-лізин у широкій ділянці рН не утворює -спіраль, а перебуває у клубковій конформації. У лужній ділянці рН (рН  11) відбувається різке зростання молярної еліптичності []_, і полі-L-лізин набуває упорядкованої конформації із 100 % -спіральністю (рис. 4.7, б). Експериментальна крива має S-подібний вигляд, що свідчить про кооперативний характер конформаційних перебудов у поліпептидному ланцюгу. Кооперативність зумовлено тим, що в упорядкованій -спіралі пептидні групи взаємопозв’язані й звільнення однієї з них вимагає розриву водневих зв’язків сусідніх груп.