4.5. Динаміка структури білків

Найбільш точним методом, який дозволяє вивчати просторову будову білкових молекул, є рентгеноструктурний аналіз. На підставі даних рентгеноструктурного аналізу молекула білка подається як статична структура, в якій неполярні амінокислотні залишки утворюють жорстке гідрофобне ядро, яке за своїми властивостями більше нагадує тверде тіло, ніж рідину. Грунтуючись на таких уявленнях важко чекати помітних змін конформації при взаємодії ферменту із субстратом.

Застосування спектральних методів (ІЧ-спектроскопії, ЯМР-спектроскопії, флуоресцентного аналізу) для вивчення білкових молекул дало змогу більш критично оцінити результати рентгеноструктурного аналізу. Воднево-дейтерієвий обмін у пептидних групах за ІЧ-спектроскопією та динамічне гасіння флуорисценції триптофанілів внутрішніх ділянок інтактних білків ставлять під сумнів статичну концепцію білкової структури і свідчать на користь динамічної структури білкових молекул. Внутрішньомолекулярна рухомість, спонтанні флуктуації структури білків зумовлено різним типом рухів атомів чи атомних груп навколо стану рівноваги.

Для білків з відомою просторовою будовою Ф. Річардс завдяки спеціальним розрахункам оцінив локальну густину білкової глобули й порівняв її з розподілом полярних і гідрофобних амінокислотних залишків у внутрішньому об’ємі білка. Виявилось, що всередині білка густина значно змінюється. Так, є ділянки з більшою густиною ( = 1,410³ кг  м^-3), яким відповідають високоупорядковані ділянки -спіралей і -структур, і ділянки з меншою густиною ( = 0,5  10³ кг  м^-3), в яких локалізовані переважно гідрофобні амінокислотні залишки. Ці дані ставлять під сумнів поняття гідрофобного ядра у глобулярних білках. Постулюється, що ділянки з малою локальною густиною утворюють гідрофобні кластери, які виконують роль м’якого рідиноподібного прошарку для відносного зміщення щільно упорядкованих структурних доменів. У різних білків внутрішній інтер’єр значно змінюється й може мати більш чи менш рухому структуру.

Усі внутрішньомолекулярні рухи в білках поділяються на швидкі спонтанні флуктуації, які відбуваються за   10^-7 с, та повільні рухи за   10^-7 с. Швидка рухомість (  10^-7 с) має локальний характер усередині макромолекули. Для таких рухів характерна залежність  від розміру атомних груп, що свідчить на користь дифузійної природи цих рухів. Час орієнтаційної рухомості  є обернено пропорційним коефіцієнту обертальної дифузії . Зі збільшенням розміру групи  зростає пропорційно кубу радіуса групи. Більшість швидких рухів виявляються на поверхні білкової глобули. Це такі рухи, як обертальна релаксація бокових груп амінокислот ( ~ 10^-9–10^-10 с), молекул вільної води ( ~ 10^-11–10^-12 с) чи зв’язаної води ( ~ 10^-8–10^-9 с).

Повільні рухи ( >10^-7 с) вимагають більш масштабних змін структури й створюються виникають унаслідок зміщеннями поліпептидних ланцюгів чи доменів білкової молекули. Робота ферментів супроводжується такими повільними рухами, про що свідчить час життя фермент-субстратних комплексів – від 10^-2 до 10^-4 с.

Якою є фізична природа флуктуацій і внутрішньомолеклярних рухів білкових молекул? Обговорюються різні моделі динаміки структури білків. Не викликає сумніву, що атоми в білковій молекули перебувають у постійному русі, а тому картина, яку дає рентгеноструктурний аналіз, відповідає певній усередненій структурі. Теплової енергії достатньо, щоб забезпечувати обертальні й коливальні рухи, які спричиняють невеликі флуктуації структури білкової молекули. Найбільш швидкі локальні зміщення за 10^-12–10^-13 с спричиняються обертанням бокових груп навколо одинарних зв’язків у поліпептидному ланцюгу. Ці обертання (на кут від 20 до 60^о) практично не узгоджені й стерично обмежені сусідніми групами. Такі локальні зміщення бокових груп нагадують броунівський рух частинок у рідині. Упродовж більш тривалого часу (10^-12–10^-11с) локальні хаотичні рухи змінюються на зкоординовані зміщення атомних груп, внесок яких у сумарні амплітуди флуктуацій атомів у білковій молекулі є суттєвими та які викликають деформацію структури білка як цілого. Значні зміщення в щільно упакованій раніше упорядкованій структурі білка можливі тільки за наявності кооперативного зміщення сусідніх атомних груп. Найбільші зміщення (до 0,2 нм) атомних груп спостерігаються на поверхні білкової глобули.

Динамічна модель білка дозволяє зрозуміти роль невеликих флуктуацій у функції ферментів. Швидкі конформаційні зміни у ферменті необхідні для просторового підгону функціональних груп в активному центрі ферменту до структури субстрату. На прикладі алкогольдегідрогенази печінки показано, що повільним великомасштабним конформаційним перебудовам, які змінюють функцію ферменту, передують високочастотні дрібні флуктуації структури. Алкогольдегідрогеназа складається із чьотирьох структурних доменів, між якими розміщений активний центр ферменту. Доступність субстрату до активного центру регулюється обертанням доменів навколо шарнірного з’єднання. Рентгеноструктурний аналіз дозволив виявити, що алкогольдегідрогеназа може перебувати у двох конформаціях: відкритій, з великою щілиною між доменами, і закритій. Після завершення хімічної реакції фермент набуває відкритої конформації й звільняється від продуктів реакції. Спонтанний перехід між цими конформаціями відбувається за більш тривалий період (~10^-9c), ніж час локальних флуктуацій (10^-12с). Припускається, що здійснення такого відносно повільного великомасштабного зміщення доменів у ферменті можливе тільки тоді, коли в результаті невеликих, достатньо швидких локальних флуктуацій відбувається зниження до мінімуму енергетичного бар’єра обертання доменів.

Такі конформаційно чутливі методи, як диференційна спектрофотометрія, флуоресцентна спектроскопія, ЯМР, метод спінових міток широко використовуються для дослідження динаміки структури й конформаційних перебудов білків.