4.4. Диференціальна скануюча мікрокалориметрія

Важливу інформацію про структурну організацію білків дає диференційна скануюча мікрокалориметрія. У цьому методі вимірюється тепло, яке необхідне для неперервного підвищення температури об’єкта на дуже малу величину.

Рис. 4.9. Блок-схема диференційного скануючого мікрокалориметра: 1 і 2 – калориметричні комірки; 3 і 4 – нагрівачі комірок; 5 – камера заповнення комірок; 6 і 7 – адіабатичні екрани; 8 – термоізолюючий екран; 9 – блок нагрівання; 10 – реєструючий пристрій; 11 – індикація температури; Т – різниця температур між комірками

Зміна ентальпії Н при розгортанні макромолекули визначається шляхом вимірювання кількості теплоти, яка необхідна для підтримування однакової температури білкового препарату і контрольного зразка (буферу) при повільному підвищенні температури їх обох. Завдяки наявності контрольного зразка вноситься поправка на зміну теплоємності розчинника. У диференційному мікрокалориметрі (рис. 4.9) розміщені дві ідентичні за масою та об’ємом калориметричні комірки 1 і 2, які підігріваються нагрівачами 3 і 4. Комірки заповнюються розчинами з камери 5. Калориметричний вузол оточують два адіабатичні екрани 6 і 7. Чутливість мікрокалориметра становить 16  10^-6 Дж  моль^-1  град^-1.

Рис. 4.10. Криві плавлення й структурна організація фібриногену:

а – доменна будова молекули фібриногену: структурні домени LТ1 і LТ2, НТ1 і НТ2; С – суперспіральні ділянки; П – ділянки розщеплення плазміном; б – криві плавлення фібриногену Ф і його фрагментів Д і Е; С_р – теплоємність

Криві плавлення білків зображуються як температурні залежності теплоємності C_р (рис. 4.10, а). За гіпотезою двох станів (НД) перехід білкової молекули з нативного (Н) у денатурований стан (Д) визначається на кривій плавлення піком C_Р, якому відповідає температура плавлення білка Т_п. Якщо в білку є структурні домени з різною термостійкістю, на кривій плавлення виявляються кілька піків C_р. Наприклад, на кривій плавлення фібриногену реєструють два піки, низькотемпературний з Т_п = 328 К і високотемпературний з Т_п = 368 К, які належать до термолабільного Д-домену і термостабільного Е-домену, відповідно (рис. 4.10, б).

За П. Приваловим, кооперативність структурних блоків білка може бути оцінено через зміну ентальпії системи. Для цього зіставляють експериментально виміряну калориметричну ентальпію Н_кал (за площею під піком теплопоглинання) з ефективною ентальпією Вант-Гоффа Н_еф, яку визначають за висотою піка С_р за температури плавлення Т_п:

(4. 8)

де Q – площа під піком теплопоглинання. У цілому має виконуватися така умова . Експериментально показано, що для невеликих білків (лізоцим, рибонуклеаза, міоглобін) . Це свідчить про те, що денатурація цих білків відбувається як процес переходу між двома станами НД і в таких білках відсутні структурні домени. У більшості великих за молекулярною масою білків ( М  20 кДа) процес денатурації проходить більш складно. Для таких білків, як імуноглобулін G, плазміноген, фібриноген, тропоміозин, міозин . Це вказує на те, що в цих білках присутні кілька структурних доменів.

Розглянемо структурну організацію одного з важливих білків згортання крові – фібриногену (М =340 кДа). Фібриноген є димерною молекулою, яка складаєься з двох ідентичних половин. Кожна з половин молекули має три неоднакові поліпептидні ланцюги ,  і , які з’єднуються разом дисульфідним вузлом в N-кінцевій частині фібриногену. На базі електронно-мікроскопічних досліджень (Хол, Слейтер, 1959) запропоновано тривузолкову тривузликову модель фібріногену у вигляді трьох з’єднаних глобулярних структур. При плазміновому чи трипсіновому протеолізі ці структури виділяються як великі структурні блоки – D- чи Д? та E-фрагменти. Дані мікрокалориметрії показали, що вони плавляться у фібриногені як незалежні структури з різними температурами Т_п (рис. 4.10, б). Ці дані лягли в основу представлення просторової структури фібриногену у вигляді одного центрального (Е) і двох периферійних (Д) структурно-функціональних доменів. Пізніше детальне дослідження плавлення фібриногену та його фрагментів показало, що у фібриногені міститься більша кількість незалежних структурних доменів з упорядкованою компактною структурою. Підставою для такого твердження є дані диференційної скануючої мікрокалориметрії: у високотемпературній ділянці Т_п = 368 К, де плавиться Е-домен, відношення , а при плавленні Д-доменів . Отже, в центральному структурно-функціональному домені Е присутні два сильно взаємодіючі термостабільні домени НТ1 (рис. 4.10, б). У кожному периферійному структурно-функціональному домені Д міститься по три термолабільні домени LТ1 з Т_п = 328 К і по одному термостабільному домену НТ2 з Т_п = 373 К. Термостабільним доменам НТ1 і НТ2 відповідають суперспіральні ділянки молекули фібриногену. Ще два термолабільні домени LT2 утворюють С-кінцеві ділянки -ланцюгів. Ці дані свідчать, що в молекулі фібриногену присутні 12 більш чи менш незалежних структурних доменів. Таке доменне представлення фібриногену має суттєве значення для розуміння тонких механізмів утворення фібринових волокон при згортанні крові.