5.11. Нуклеїново-білкове впізнавання

Функціонування нуклеїнових кислот тісно пов’язане з нуклеїново-білковим упізнаванням, яке є одним з найскладніших виявів живого на молекулярному рівні. Тому пошук загальних фізико-хімічних закономірностей, які лежать в його основі, є одним із фундаментальних напрямів біофізики. Незважаючи на важливість проблеми, наші знання про механізм тонкої взаємодії між білками й нуклеїновими кислотами є досить обмеженими. Сучасний стан даної проблеми характеризується накопиченням і систематизацією експериментальних даних, найбільш інформативними з яких є дані спектроскопії ЯМР і рентгеноструктурного аналізу. Нині вважається, що важливими параметрами впізнавання є площа й топографія взаємодіючих поверхонь білка й нуклеїнової кислоти та їхня афінність. Визначальну роль у нуклеїново-білковому впізнаванні відіграє динаміка молекул-партнерів, у першу чергу, ДНК (напіврозкритий стан, здатність до локальних вигинів).

Головні труднощі при вивченні цих складних гетерогенних систем полягають у тому, що потрібно одночасно спостерігати за кожним взаємодіючим компонентом і враховувати геометрію цих макромолекул. Спектральні методи в цьому разі дають неоднозначні результати, а кристалізація білків з нуклеїновими кислотами пов’язана з великими методичними проблемами. Для спрощення вивчення цих складних систем і встановлення існуючих закономірностей досліджують модельні сполуки, головним чином, для встановлення специфічності взаємодії чотирьох основ нуклеїнових кислот з боковими групами амінокислот. Використовуються як мономерні, так і полімерні складові білків і нуклеїнових кислот, в тому числі й синтетичні. Такі дослідження дають уявлення про загальні принципи нуклеїново-білкового впізнавання, але, без сумніву, узагальнення й кінцеві висновки можна робити тільки на основі вивчення функціональних комплексів.

Базуючись на загальних фізико-хімічних уявленнях про властивості білків і нуклеїнових кислот, можна виділити такі типи взаємодії між ними:

1. електростатичні взаємодії між залишками фосфорної кислоти й аміногрупами лізину та аргініну;

2. стекінг-взаємодії між боковими групами ароматичних амінокислот (Тrp, Тyr, Phe) й основами;

3. водневі зв’язки;

4. гідрофобні взаємодії між неполярними амінокислотами й основами.

Аналіз кристалічних структур деяких глобулярних білків показав, що антипаралельний -шар у них закручений у праву спіраль, кривизна якої добре збігається з кривизною поверхні подвійних спіралей ДНК і РНК. Антипаралельний -шар вписується в мінорну канавку А-РНК. Структуру стабілізовано водневими зв’язками між гідроксильними групами рибози й пептидними групами. Взаємодія між подвійними спіралями нуклеїнових кислот і поліпептидними -спіралями, швидше за все, забезпечується за рахунок бокових груп амінокислотних залишків, без участі пептидних груп, які задіяні у формуванні -спіралі білка.

Детальніші уявлення про нуклеїново-білкові взаємодії дають дослідження модельних структур, достатньо наближених до реально існуючих у природі. За допомогою рентгеноструктурного аналізу з роздільною здатністю 0,25 нм встановлено тривимірну структуру комплексів, які утворює ТАТА-бокс ДНК з білками, що зв’язуються з ТАТА-боксом (TATA-box binding protein, TBP). ТАТА-бокс – це характерна послідовність нуклеотидів у ДНК, що утворює промотор в еукаріотів. Формування зазначеного нуклеїново-білкового комплексу викликає суттєві зміни у структурі ДНК.

Ініціація транскрипції генів РНК-полімеразою вимагає, крім наявності ферменту, присутності цілої низки інших білкових факторів, які утворюють специфічний мультибілковий комплекс біля сайта початку транскрипції шляхом взаємодії з елементами промотору. Еукаріоти залежно від генів, які вони транскрибують, використовують одну з трьох РНК-полімераз, що мають між собою багато спільного, включаючи допоміжні білки (білкові фактори). ТВР зв’язуються з високою спорідненістю з ТАТА-боксом і працюють з усіма РНК-полімеразами. ТВР мають видові відмінності, але містять С-кінцевий домен, що складається із 180 амінокислотних залишків, який є висококонсервативним філогенетично, як і сам ТАТА-бокс.

На рис. 5.23 наведно нуклеотидну послідовність типового ТАТА-боксу, яка використана для спільної кристалізації з ТВР із дріжджів для рентгеноструктурних досліджень.

1

2

3

4

5

6

7

8

5

Г

Т

А

Т

А

Т

А

А

А

А

Ц

Г

3

Ц

А

Т

А

Т

А

Т

Т

Т

Т

Г

Ц

Рис . 5.23. Нуклеотидна послідовність ТАТА-боксу

Структура ТВР, яка містить 10-ланцюговий антипаралельний -шар і чотири -спіралі, за формою нагадує сідло. Молекула має вісь симетрії другого порядку й складається з двох субдоменів з аналогічною амінокислотною послідовністю. З кожного боку сідла розташовані дві петлі, утворені антипаралельними -структурами. Кожна петля містить два консервативні залишки фенілаланіну, які, як показано в дослідах з мутагенезу, необідні для зв’язування з ДНК.

При зв’язуванні ТВР з ДНК остання зазнає суттєвих структурних змін, розкручуючись і згинаючись, тоді як структура білка практично не змінюється за виключенням невеликої зміни кута між двома доменами. Отже, ТВР є не просто пасивним сідлом, а прилаштовує структуру ДНК до своєї вигнутої поверхні.

Кристалічна структура комплексів містить ділянку з восьми пар нуклеотидів (виділена на рис. 5.23), яка тісно взаємодіє з білком і суттєво відрізняється від В- форми подвійної спіралі ДНК. Взаємодія ТВР з ТАТА-елементом викликає вигин ДНК приблизно на 80^о і, як наслідок, її розкручування на 110^о. Як результат, мінорна канавка ТАТА-елементу розширюється й розгладжується, утворюючи чисельні гідрофільні й гідрофобні контакти з поверхнею білка. Зміна структури ДНК відбувається за рахунок зміни кутів, утворених ковалентними зв’язками в полінуклеотидному ланцюгу між нуклеотидами1 і 8. Особливо значними є зміни між нуклеотидами 1 і 2 та 7 і 8 (рис. 5.23) й настільки, що їх правильніше класифікувати як “кінки”.

Можлива роль цих структурних змін полягає в тому, що розкручування ТАТА-боксу сприяє розділенню двох ланцюгів ДНК, що необхідно для ініціації транскрипції. Комплементарна пара А–Т є менш стабільною (порівняно з парою Г–Ц), і цим, мабуть, пояснюється той факт, що ТАТА нуклеотидні послідовності містяться в тих ділянках ДНК, де має відбуватися ініціація розділення ланцюгів. Узагальнюючи, можна зазначити, що ДНК не виконує ролі пасивного елементу при її взаємодії з білками, а її нуклеотидна послідовність, завдяки фізичним властивостям, несе другий, фізичний рівень інформації, який доповнює хімічне впізнавання між індивідуальними функціональними групами, що взаємодіють.

Контрольні запитання 1 задачі до частини ІІ

1. Седиментація розчину білка відбувається на швидкості обертання ротора n = 57000 хв^-1 за Т = 293 К. Зміщення (х) шлірен-піка від осі обертання ротора реєструвалось через фіксований час t: t₁ = 0, х₁ = 6,55 см; t₂ = 8 хв, х₂ = 6,58 см; t₃ = 16 хв, х₃ = 6,61 см. На ультрацентрифузі визначали коефіцієнт дифузії за зміною в часі форми шлірен-піка (висота Н і площа S): t₁ = 1000 с, Н₁ =0,5 см і S₁ = 0,0453 см²; t₂ = 2000 с, Н₂ = 0,352 см і А S S₂ = 0,0453 см²; t₃ = 4000 с, Н₃ = 0,248 см і S₃ = 0,0453 см². Визначити молекулярну масу й коефіцієнт дифузії білка, якщо питомий парціальний об’єм = 0,7  10^-3 м³/кг і густина буферу ₀ = 10³ кг/м³.

2. Визначити іонну силу розчину: 1) КСl, концентрація 10^-1 моль/л 2) СаСl₂, концентрація 10^-3 моль/л.

3. На дихрографі визначено вторинну структуру білка. Знайдено, що в білку міститься 80 % -спіралей і 20 % неупорядкованої структури. Зобразити графічно спектр КД досліджуваного білка.

4. На спектрофотометрі реєструється спектр поглинання білка. Відомо, що в цьому білку містяться два триптофаніли й 10 тирозилів. Яка оптична густина на  = 280 нм реєструється в кюветі товщиною l = 0,01 м, якщо концентрація білка С = 5  10^-5 моль/л? При цьому коефіцієнти молярної екстинції для триптофану  = 5,6  10⁵ моль  м^-1 і тирозину  = 1,2 10⁵ моль  м^-1.

5. При підвищенні температури на 10⁰ швидкість ферментативної реакції збільшилася у два рази. Розрахувати енергію активації цієї реакції, якщо спочатку вона відбуваддася за Т = 300 К.

6. Константа ферментативної реакції К_м = 3  10^-3 моль/л, константа пригнічуючого конкурентного інгібітора К_і = 3  10^-5 моль/л. Якою (за концентрації субстрату 3  10^-4 моль/л) має бути концентрація інгібітора, що додається, щоб зменшити швидкість реакції у два рази?

7. Електрофоретична рухомість досліджуваного білка більша в 1,2 рази за рухомість еталонного білка. На скільки меншою є молекулярна маса досліджуваного білка, якщо для еталонного білка М = 60000 Да? Для оцінки молекулярної маси використати графічну залежність на рис. 3. 11, б.

8. Назвати всі типи взаємодій, які стабілізують подвійну спіраль ДНК.

9. На скільки градусів зміниться температура плавлення ДНК, якщо кількість ГЦ-пар у ДНК збільшити від 20 до 60 %?