5.10. Клонування днк

Одержання ДНК для клонування. ДНК для клонування може бути отримано хіміко-ферментативним синтезом, зворотною транскрипцією мРНК або шляхом безпосереднього розщеплення геномної ДНК необхідною рестрикційною ендонуклеазою.

При зворотній транскрипції еукаріотичної мРНК частіше усього використовується той факт, що на її 3-кінці, як правило, міститься полі(А)-послідовність, завдяки якій як затравку для зворотної транскрипції можна застосовувати оліго dT). На першій стадії зворотна транскриптаза синтезує одноланцюгову ДНК, що є комплементарною мРНК. Ця ДНК, як правило, містить на З-кінці «шпильку». Після видалення РНК при обробці лугом або РНКазами утворюється одноланцюгова ДНК, що служить затравкою-матрицею для фрагмента Кленова і за наявності чотирьох дезоксинуклеозидтрифосфатів (dNTP) добудовує другий ланцюг. Фрагмент Кленова, або великий фрагмент ДНК-полімерази І утворюється при м’ягкому розщепленні даної полімерази субтилізином і має як полімеразну, так і З- і 5-екзонуклеазну активність. У результаті шпилькова структура після обробки Si-нуклеазою перетворюється на справжню дволанцюгову кДНК (рис. 5.22). Далі цю кДНК можна вбудувати у відповідний вектор (плазміду або бактеріофаг) за допомогою лінкерів або конекторної техніки.

Процес уведення плазміди у клітину, що викликає спадкові зміни в ній, називається трансформацією. Процес інфекції клітин за допомогою чужорідних ДНК, що приводить до утворення зрілого фагового нащадка, називається трансфекцією. Практично найбільш загальний спосіб трансформації й трансфекції грунтується на тому, що при обробці клітин бактерій CaCl₂ їхня мембрана стає проникною для ДНК. Ефективність проникнення екзогенної ДНК у клітину є низькою. Для плазмід типу pBR322 можна одержати 10⁶–10⁷ трансформантів при додаванні 1 мкг плазміди до оброблених CaCl₂ клітин, тобто з кожних 10⁴–10⁵ плазмід у клітини потрапляє тільки одна. Тому серед бактерій, що зазнали трансформації, тільки невеличка частина виявляється трансформованою. Відділення їх від загальної маси виконується у процесі клонування. Операція полягає в посіві бактеріальної суспензії певної концентрації на тверде поживне середовище, наприклад, на агар з поживними добавками в чашці Петрі таким чином, щоб на 1 см² поверхні припадало 5–10 бактерій. Бактеріальна клітина, що потрапила на поверхню агару, починає ділитися, і в кінцевому рахунку в точці локалізації утвориться сімейство її нащадків у вигляді маленької колонії, за зовнішнім виглядом подібної на капелюшок гриба. Ця колонія називається клоном. Кожна клітина вихідної суспензії утворить свій клон, усі клітини якого мають властивості бактерії-родоначальника (позитивна колонія).

Рис. 5.24. Схема підготовки кДНК до клонування.

Якщо вектором служить плазміда pBR322, то для відбору бактерій-трансформантів використовують додавання в поживний агар антибіотика – ампіциліну або тетрацикліну – залежно від того, який з генів стійкості до антибіотиків залишився інтактним після введення чужорідної ДНК. На такому середовищі клони утворять тільки клітини з плазмідами. Відбір за певною біологічною ознакою, зокрема, за стійкістю до антибіотика, називається селекцією.

Клонування при використанні як вектора бактеріофага  здійснюється в такий спосіб: до суспензії бактерій, оброблених СаСl₂, додається ДНК фага і здійснюється посів на чашку Петрі аналогічно до попереднього методу. Клітини, що не містять ДНК фага, розмножуються на агарі й дають мутний рівний «газон», що заповнює всю поверхню чашки. Проте в тих точках, куди потрапили бактерії з ДНК фага, залишаються прозорі круглі плями, що звуться бляшками, або негативними колоніями. Утворення бляшок пов'язано з тим, що ДНК фага реплікується у клітині й дає зрілі фагові частинки. Потім вони потрапляють у середовище, заражають навколишні клітини й руйнують їх. У результаті кожна бляшка складається з нащадків фагів, що містять ту саму ДНК (копію ДНК), що потрапила у клітину.

Фаги типу М13 не дають негативних колоній, оскільки вони не руйнують клітини. Проте в місці їх розмноження клітини Е. coli уповільнюють поділ, що приводить до появи на загальному мутному газоні більш прозорих бляшок.

Ідентифікація клонів. Якщо вставка містить гени, здатні до експресії в новому хазяїні, рекомбінантні клони може бути ідентифіковано за синтезованим ними продуктом. Проте частіше доводиться ідентифікувати безпосередньо нуклеотидну вставку, для чого використовують методи гібридизації. Бактеріальні (або фагові) колонії вирощуються на нітроцелюлозних фільтрах, розміщених на чашці Петрі з поживним середовищем. Після цього готують так звані репліки: до фільтра з вихідними колоніями притискають свіжий нітроцелюлозний фільтр, який потім переносять на чашку Петрі з поживним середовищем, де на ньому утворяться колонії, ідентичні першим.

Далі фільтр-репліку піддають лужній обробці, клітини в колоніях зазнають лізису, й денатурована ДНК з клітин зв'язується з нітроцелюлозою в тому місці, де розташовувалася відповідна колонія. За використання радіоактивної (³²Р- або ¹²⁵I-мічена) ДНК або РНК, що комплементарна необхідній вставці, при витримуванні фільтра в розчині, що містить радіоактивний полінуклеотид, останній гібридизується з комплементарними послідовностями. У результаті ті частини фільтра, в яких містяться рекомбінантні клони з необхідною вставкою, виявляються радіоактивними й ідентифікуються радіоавтографічно.

Проблеми експресії чужорідних генів. При включенні бактеріальних генів разом з їхніми регуляторними ділянками в Е. coli вони, як правило, експресуються, даючи мРНК і білок. Це відбувається тому, що в сигнальних послідовностях, що керують транскрипцією й трансляцією в різноманітних прокаріотичних організмах, багато спільного. Проте експресія генів еукаріотів у бактеріях відбувається рідко, якщо не створено спеціальних умов. Регуляторні сигнали еукаріотів значно відрізняються від регуляторних сигналів бактерій і не впізнаються бактеріальними РНК-полімеразами й рибосомами. При клонуванні не кДНК, а геномної ДНК еукаріотичної клітини експресії не відбувається, оскільки в бактеріальній клітині відсутня система «сплайсингу». Тому для здійснення експресії еукаріотичного гена відповідна кДНК або синтетична ДНК, що містить кодуючу послідовність, приєднуються у складі векторної молекули до регуляторних елементів бактерії – промотору і рибосому -зв’язуючій ділянці. Іноді це вібувається таким чином, що кодуюча частина еукаріотичного гена приєднується до кодуючої частини бактеріального гена так, щоб зберігалася «рамка» зчитування. В останньому випадку утворяться гібридні білки, що містять у N-кінцевій частині бактеріальний білок або його частину, а в С-кінцевій – еукаріотичний білок.

Такий спосіб експресії використовується, коли можливе відщеплення пептиду, що експресується від N-кінцевої частини химерного білка, або коли достатньо одержати гібридний поліпептид, наприклад, у випадку одержання штучних вакцин, де достатньо наявності необхідних антигенних детермінант.

Для одержання білків, що містять більше 150 амінокислот, частіше використовується пряма експресія відповідних генів, у результаті якої відразу синтезуються необхідні білки лише з незначною модифікацією. При цьому кодуюча частина гена з'єднується з бактеріальним промотором й ініціюючим кодоном ATГ.

Саме в такий спосіб отримано штами Е. coli, що продукують гормон росту людини, інтерферони людини й інші білки, що має велике практичне значення. Приєднання до кодуючої частини гена ініціюючого кодону необхідне для забезпечення ініціації трансляції. Це приводить до того, що N-кінцева частина синтезованих таким спобом поліпептидів відрізняється від природних присутністю N-кінцевого формілметіоніну. Ферменти процесингу бактеріальної клітини частково видаляють її, проте частина синтезованого білка все ж зберігає модифікацію. У багатьох випадках така модифікація не змінює фізіологічних властивостей продукту, але при одержанні лікарських препаратів необхідно враховувати можливий її ефект.

Клонування в різних організмах. У даний час розроблено системи клонування різних бактерій, дріжджів, грибів, рослин і ссавців. Найбільший практичний інтерес становлять системи клонування у грампозитивних бактеріях, багато з яких використовуються промислово, а також у дріжджах і клітинах вищих організмів.

Як правило, вектори для клонування в таких системах являють собою подвійні реплікони, що можуть існувати і в Е. coli, і в тій клітині-хазяїні, для якої вони призначені. Це досягається створенням гібридних векторів, що містять реплікон якоїсь із плазмід Е. coli й необхідний реплікон, наприклад плазміди В. subtilis або дріжджів, що дозволяє проводити початкове клонування й відбір необхідних генів у добре вивченій системі Е. coli, а потім уже вводити виділені рекомбінантні плазміди в новий організм.

Такі вектори мають містити в собі ген або гени, що надають клітині-хазяїну ознаку, яка легко тестується, наприклад, стійкість до антибіотиків.

Клонування у дріжджах. Найбільш широко використовуються штами Saccharomyces cerevisiae. Робота із дріжджами полегшується тим, що, як і бактерії, вони можуть рости в рідкому середовищі, створювати колонії на твердому середовищі, є добре генетично охарактеризованими й мають порівняно короткий час генерації. S. cerevisiae містить плазміду Scpl, що являє собою циклічну молекулу довжиною 2 мкм. Її гібриди з плазмідами Е. coli, як правило, використовують як векторт. Селекція дріжджових клонів, трансформованих такими рекомбінантними плазмідами, грунтується на застосуванні як клітин-хазяїв певних мутантів, неспроможних рости на середовищі, позбавленому якогось поживного компонента. Векторна плазміда, у свою чергу, містить ген або гени, що при попаданні у клітину надають їй цю відсутню ознаку. Трансформанти легко відібрати за їхньою спроможностю створювати колонії на збідненому середовищі.

Оскільки дріжджі є еукаріотичним організмом, можна було б очікувати, що гени різноманітних еукаріотів, у тому числі й ті, що містять інтрони, коректно експресуватимуться у дріжджових клітинах. Але це не так. Наприклад, експресія генів -глобіну кролика у дріжджах не відбувається через некоректність транскрипції й наступного «сплайсингу» РНК. Проте, використовуючи прийоми, аналогічні застосованим при клонуванні в бактеріях, вдається досягти синтезу чужорідних білків у дріжджових клітинах. Такі клітини, як і В. subtilis, секретують значну кількість білка в позаклітинне середовище, що використовують також для секреції чужорідних білків. Із цією метою до гена, що експресується, приєднується ділянка, який кодує сигнальний пептид, що зумовлює секрецію, яка потім і відщеплюється. У результаті у клітині синтезується білок, що містить на N-кінці сигнальний пептид. Цей білок секретується в навколишнє середовище. У такий спосіб було отримано, наприклад, штами дріжджів, що секретують інтерферон людини.

Генна інженерія рослин. Ця галузь генної інженерії не так добре розроблено, як мікробних клітин. Проте в даний час вона привертає дуже велику увагу, оскільки відкриває нові перспективи в рослинництві. Звичайна селекція нових сортів – процес повільний, і, крім того, вона обмежена природними видовими бар'єрами. Введення нових генів за допомогою техніки рекомбінантних ДНК у рослини могло б прискорити цей процес й істотно розширити його можливості. Крім того, рослини мають істотну особливість: в багатьох випадках рослину може бути вирощено з окремої клітини. При розчиненні целюлозної стінки рослинної клітини ферментами целюлазами утворюються протопласти, в які легко проникають макромолекули, в тому числі ДНК. Дві різні клітини у вигляді протопластів з'єднуються з утворенням гібридного протопласта (соматичної гібридної клітини). Протопласти здатні відновлювати клітинну стінку, й далі давати цілу рослину. Рослину може бути отримано з протопластів, що включають чужорідну ДНК, або з гібридних протопластів.

За наявності методів уведення в рослинні клітини певних генів, здатних до функціонування й стабільного успадкування, відкриваються реальні можливості створення рослин із заздалегідь заданими корисними якостями.