5.8. Ренатурація й кінетика ренатурації денатурованої днк

Процес відновлення зруйнованої вторинної структури ДНК називається ренатурацією. Критеріями повноти ренатурації є:

ренатурована ДНК має такі самі оптичні властивості (гіпохромізм, спектри ДОО, КД), як і відповідні нативні препарати;

збіг гідродинамічних характеристик ренатурованих ДНК з нативними ДНК;

збіг рентгенограм ренатурованої й нативної ДНК.

Сукупність цих даних дозволяє стверджувати, що ренатурована ДНК за фізичними власивостями відповідає нативній. Робити остаточний висновок про нативність ДНК можна тільки на основі біологічної активності. Існують два типи факторів, які впливають на процес ренатурації: структурні фактори, залежні від властивостей самої ДНК, і фактори, пов’язані з умовами ренатурації. Структурні фактори – це молекулярна маса й нуклеотидний склад.

Кінетика ренатурації значною мірою залежить від температури нагрівання розчину ДНК. Ми говорили раніше, що плавлення ДНК не завжди супроводжується розривом усіх водневих зв’язків і розходженням ниток ДНК. Якщо швидко охолодити розчин ДНК, нагрітий до певної температури в межах кривої плавлення, то ренатурація відбувається миттєво. Зрозуміло, що це мономолекулярний процес, який не вимагає зіткнень, і тому проходить швидко й повно. За перегріву розчину на 10–15^оС вище температури зникнення гіперхромного ефекту ДНК переходять у новий стан, який характеризується повним розділенням ланцюгів і ренатурує повільно. У цьому випадку спостерігається значна чутливість процесу до гетерогенності ДНК.

Кінетику ренатурації ДНК може бути вивчено кількісно. Припустимо, що розчин денатурованої ДНК містить фрагменти ланцюгів ДНК однакової довжини (такі фрагменти отримують шляхом дозованого гідродинамічного руйнування ДНК). Припустимо також, що денатурація в момент часу t = 0 є повною, тобто всі подвійні ланцюги розійшлись. Якщо на початковий момент існують умови для ренатурації, то можна написати рівняння бімолекулярної кінетики для кожного типу фрагментів ДНК.

, (5.6)

де с – концентрація відповідних денатурованих ланцюгів у певний момент часу t.

Розв’язок рівняння має вигляд:

, (5.7)

де С – концентрація одноланцюгових ДНК, що не вступили в комплекс; C_о – початкова концентрація одноланцюгових ДНК.

З рівняння видно, що критерієм, який характеризує швидкість ренатурації, є не час t, а С_оt – добуток часу й сумарної вагової концентрації ДНК. Константа К визначається за умови, коли , і тоді, згідно з рівнянням (5.7), КС₀t = 1, а час, який відповідає цій умові, позначається як t_1/2.

Чим більшою є величина С₀t_1/2, за якої відбувається ренатурація половини фракцій ДНК, тим меншою є кількість однакових послідовностей у фракції.

Для вивчення кінетики ренатурації запропоновано зручний метод. Існує сорбент, який специфічно поглинає тільки ренатуровану дволанцюгову ДНК. Це гідроксіапатит Са₁₀(РО₄)₆(ОН)₂, яким заповнюють колонки й розділяють денатуровані й ренатуровані ДНК при хроматографуванні. Кінетику ренатурації ДНК зручно представляти графічно (рис. 5.20).

Рис. 5.20. Криві кінетики ренатурації ДНК з тимусу теляти 1 і Е. coli 2

З рис. 5.20 видно, що крива ренатурації ДНК тимусу є складною й являє собою накладання принаймні двох кінетичних кривих. Перша частина кривої відповідає 40 % ДНК, яка ренатурує швидко (С₀t_1/2 посередині кривої ренатурації становить 0,03). Друга частина ДНК (~60%) ренатурує повільно (С₀t_1/2 посередині кривої становить 3  10³).

Що ж означають перші 40 % ДНК з високою швидкістю ренатурації? Природно припустити, що це нуклеотидна послідовність, яка багаторазово повторюється вздовж ланцюга ДНК.

Можна досліджувати кінетику ренатурації одноланцюгових денатурованих фрагментів ДНК, визначаючи в кожен певний момент реакції кількість уже ренатурованих дволанцюгових ДНК. Кінетичні параметри реакції кількісно характеризують ступінь різноманітності послідовностей ДНК, чи складність. Значення С₀t_1/2, коли ренатурує 50 % ДНК, характеризує ступінь складності геному. Складність ДНК визначається загальною довжиною в нуклеотидних парах (н. п.) різних унікальних послідовностей ДНК, які містяться в дослідному зразку ДНК. Виявляється, що значення С₀t_1/2 для ДНК Е.coli (~9) приблизно у 30 разів більше, ніж для ДНК фага Т4 (0,3). Дійсно, вміст ДНК у клітинах Е. coli (5  10⁶ н. п) також у 30 разів більший, ніж у фага (1,7  10⁵ н. п.). Зі збільшенням ступеня поліплоїдизації складність геномної ДНК, як і кінетика ренатурації, змінюватися не буде.