5.7. Оптичні характеристики і гіперхромний ефект днк

Спектри поглинання УФ-світла мономерних нуклеозидів і нуклеотидів за нейтральних рН зливаються в одну широку смугу з _max  260 нм. Квантово-хімічні розрахунки показують, що інтенсивне поглинання УФ-світла пов’язане з   ^*-переходами. Певний внесок у це поглинання вносять також n  ^*-переходи. Коефіцієнт молярної екстинції для нуклеїнових кислот загалом є на порядок більший порівняно з білками.

При денатурації оптична густина ДНК зростає приблизно на 30 %. Це явище отримало назву гіперхромного ефекту. Зворотний перехід, тобто зменшення поглинання ДНК при ренатурації, називається гіпохромним ефектом. Дослідження показують, що гіпохромний ефект зумовлено вертикальними (стекінг) взаємодіями, які відбуваються в нативній ДНК. Кількісно він оцінюється через відсотковий гіпохромізм Н:

, (5.3)

де f_g і f_m – сила осцилятора відповідно полімеру й мономера, які безпосередньо пов’язані з величиною моменту електронного переходу й можуть бути визначені експериментально з площі смуги поглинання, що відповідає даному електронному переходу у спектрі за формулою:

, (5.4)

де ₁ – довжина хвилі мінімуму поглинання в короткохвильовій ділянці; ₂ – довжина хвилі кінця смуги поглинання в довгохвильовій ділянці;  – молярний коефіцієнт екстинції. На рис. 5.17 зображено спектри поглинання ДНК у різних її станах. З рисунка видно, що руйнування подвійної спіралі ДНК викликає гіперхромний ефект (зростає поглинання), але не повною мірою, оскільки певні стекінг-взаємодії ще залишаються. Повністю ці взаємодії зникають у випадку мономерів, концентрація яких така сама, як і в ДНК.

Рис. 5.17. Спектр поглинання нативної дволанцюгової ДНК 1, денатурованої ДНК 2 і мономерних нуклеотидів, що входять до її складу 3

Друга важлива властивість подвійних спіралей ДНК – велике питоме обертання площини поляризованого світла, яке приблизно в шість разів більше порівняно з мономерними нуклеотидами такої самої концентрації.

Подвійну спіраль ДНК може бути зруйновано під дією різних факторів (зміна іонної сили, рН, температури). Процес денатурації супроводжується розплетенням подвійної спіралі й утворенням двох одноланцюгових молекул ДНК у стані статистичного клубка. За деякими фізичними властивостями в даному випадку простежується аналогія між спіраллю ДНК і кристалом: руйнування структур (плавлення) відбувається кооперативно за певної температури, а ріст кристалу, чи ренатурація ДНК, починається після утворення зародка. Кооперативний механізм утворення спіралі ДНК (механізм “застібки-блискавки”) вимагає наявності зародка, що складається, як мінімум, з трьох пар основ. Після формування такого зародка, який може легко зруйнуватися, додавання нової пари стає енергетично вигідним і супроводжується зменшенням вільної енергії. Подальший ріст спіралі відбувається самовільно. Цьому процесу сприяє утворення водневих зв’язків між комплементарними парами та стекінг. Спільна дія цих факторів зумовлює кооператівність як утворення спіралі (див. ренатурація ДНК), так і її руйнування (плавлення).

Залежність оптичної густини ДНК від температури D₂₆₀ = f(T) називається кривою плавлення ДНК (рис. 5.18).

Рис. 5.18. Крива плавлення ДНК

Температура плавлення (Т_п) ДНК супроводжується гіперхромним ефектом. Інтервал температури плавлення ДНК (T_п) є досить широким у межах 3–7^оС і тим вужчим, чим більш гомогенною є ДНК. Вихід кривої на плато не викликає повного розділення ланцюгів подвійної спіралі ДНК. Для того, щоб це відбулося, потрібно “перегріти” розчин ДНК приблизно на 15^о після досягнення максимального значення гіперхромного ефекту. Т_п ДНК визначається як середина переходу на кривій плавлення ДНК.

Експериментально показано, що температура плавлення ДНК залежить від нуклеотидного складу:

T_п = T_АТ + (T_ГЦ – T_АТ) x, (5.5)

де х – частка ГЦ пар, T_АТ і T_ГЦ – температура плавлення полінуклеотиду з АТ-пар і ГЦ-пар, відповідно. Існує лінійна залежність Т_п ДНК від ГЦ-складу (рис. 5.19).

Екстраполяція лінійної залежності Т_п від частки ГЦ-пар до значень х = 0 і х = 1 дає відповідно 69 і 110^оС, що добре узгоджується з експериментальними даними для відповідних синтетичних полінуклеотидів (65 і 104^оС). Крім нуклеотидного складу, температура плавлення ДНК залежить ще від багатьох факторів, з яких найбільш суттєвими є:

• іонна сила. Т_п подвійних спіралей полінуклеотидів підвищується зі збільшенням іонної сили розчину. Існує лінійна залежність Т_п від логарифма концентрації одновалентних катіонів (до концентрації 0,3 моль/л). За більш високої концентрації солей Т_п ДНК не змінюється або навіть зменшується. За концентрації солей приблизно 10^-4 моль/л ДНК денатурує за кімнатної температури. Вплив двовалентних катіонів має певну специфічність. Наявність таких катіонів, як Cu, Cd, Pb зменшує температуру плавлення ДНК, тодлі як інші (Mg, Ba, Co, Mn, Ni, Zn) збільшують температуру плавлення ДНК.

Рис. 5.19. Залежність Т_п ДНК від нуклеотидного складу. Квадрат – плавлення полі АТ, трикутник – плавлення полі ГЦ. Точки на графіку відповідають Т_п ДНК відповідного нуклеотидного складу

рН середовища. Т_п. ДНК значною мірою залежить від рН. За рН  2,7 і рН  12 денатурація ДНК відбувається за кімнатної температури. В інтервалі рН від 5,5 до 8,5 Т_п ДНК незначною мірою залежить від рН середовища. Вплив рН на температурну стабільність ДНК зумовлено іонізацією основ.