4.13. Алостеричні ферменти. Регуляція хімічних реакцій у клітині

Розглянемо ще один важливий клас ферментів, за участю яких регулюються й контролюються метаболічні процеси у клітині. Метаболіти мають продукуватися в необхідних кількостях і з мінімальними витратами енергії.

Рис. 4.36. Біологічна регуляція за типом зворотного зв’язку: Тр – треонін; К_б – кетобутират; А_б – ацетогідроксибутират; Д_б – дигідроксиметилвалерат; К_в – кето-метилвалерат; Із – ізолейцин; Е₁ – треоніндезаміназа; Е₂ – синтетаза ацетогідроксикислот; Е₃ – ізомероредуктаза ацетогідроксикислот; Е₄ – дегідраза дегідроксикислот; Е₅ – трансаміназа В

Синтез у клітині амінокислоти L-ізолейцину починається з L-треоніну й проходить через низку проміжних етапів (рис. 4.36). Експериментально виявлено, що активність треоніндезамінази, першого ферменту Е₁ на біосинтетичному шляху регулюється кінцевим продуктом – L-ізолейцином. Усі інші ферменти Е₂, Е₃, Е₄ і Е₅ не інгібуються L-ізолейцином. Інгібування треоніндезамінази є високоспецифічним: L-лейцин у 100 разів менш ефективний, ніж L-ізолейцин, а ізомер Д-ізолейцин взагалі не інгібує треоніндезаміназу. На базі цих даних запропонований механізм регулювання біосинтезу L-ізолейцину. В інтактній клітині підвищення концентрації L-ізолейцину інгібує треоніндезаміназу. Це спричиняє зменшення швидкості всіх реакцій синтезу L-ізолейцину. Зниження концентрації L-ізолейцину усуває ефект інгібування, що сприяє зростанню швидкості каталітичного перетворення L-треоніну в кінцевий продук – L-ізолейцин. Отже, кінцевий продукт є хімічним сигналом для управління активністю треоніндезамінази. Це приклад регуляції активності ферменту за типом від’ємного зворотного зв’язку. Слід зазначити, що треоніндезаміназа не регулюється за типом конкурентного інгібування. Кінцевий продукт L-ізолейцин структурно не є схожим на L-треонін. Треоніндезаміназа, крім активного центру, в якому каталізується перетворення L-треоніну, має специфічний ефекторний центр, до якого приєднується L-ізолейцин і змінює активність ферменту.

Добре вивчено регуляцію біосинтезу піримідинових нуклеотидів в E.coli. У цій регуляції бере участь складний фермент аспартаттранскарбамоїлаза (АТКаза). Підвищення концентрації цитидин трифосфату (ЦТФ) є інгібуючим сигналом зменшення активності АТКази (відємний зворотний зв’язок). Надлишок АТФ усуває інгібуючий ефект, і відбувається активація АТКази (додатний зворотний зв’язок). Отже, пиримідинові нуклеотиди є специфічними хімічними сигналами, які регулюють активність АТКази.

Регуляторні білки мають низку характерних і важливих особливостей.

1. Інгібування або активація метаболічними ефекторами відбувається тому, що регуляторні ферменти мають специфічні ефекторні центри, які просторово віддалені від каталітичних центрів. Центри зв’язування ефекторів називаються алостеричними центрами, а ферменти, які мають такі центри, – алостеричними ферментами.

2. Численні ферменти, активність яких регулюється за алостеричним механізмом, мають S-подібні криві залежності швидкості реакції від концентрації субстрату. Такі алостеричні ферменти виявляють кооперативну кінетику. Кооперативні характеристики добре ілюструються у випадку зв’язування О₂ гемоглобіном (рис. 4.37). Міоглобін, який у м’язах використовується для запасання кисню, не виявляє кооперативних властивостей, і його кінетична залежність нагадує ленгмюрівську криву адсорбції.

Рис. 4.37. Криві зв’язування кисню міоглобіном (1) і гемоглобіном (2):

Y – ступінь насичення білка; [L] – концентрація ліганду

3. Одна із характерних особливостей білків, які виявляють алостеричні й кооперативні ефекти, полягає в їхній субодиничній будові. Міоглобін – мономерний білок, який складається з одного поліпептидного ланцюга й однієї гем-групи, гемоглобін – із чотирьох субодиниць (дві - і дві -субодиниці), які утворюють тетрамерну структуру із чотирма гем-групами, що зв’язують кисень. Четвертинна структура характерна і для інших алостеричних білків: фосфоліпаза в має дві субодиниці, треоніндезаміназа – чотири.

АТКаза (М = 300 кДа) є мультисубодиничним білком, який складається з двох каталітичних (К) тримерів (М = 100 кДа) і трьох регуляторних (Р) димерів (М = 34 кДа) (рис. 4.38).

Рис. 4.38. Схематичне розміщення субодиниць в аспартаттранскарбамоїлазі (АТКазі): ККК – каталітичні тримери; РР – регуляторні димери

Методом рентгеноструктурного аналізу визначено атомну, тримірну структуру АТКази з розділенням 0,3 нм. У зоні контакту між К- і Р-субодиницями розміщуються атоми цинку. Фермент має шість каталітичних і шість алостеричних центрів. Ефекторні центри, які розташовані на Р-субодиницях, віддалені на 6 нм від каталітичних центрів, які локалізовані на К-субодиницях. Отже, вплив ЦМФ і АТФ на активність АТКази справляють конформаційні зміни ферменту, які передаються від Р- до К-субодиниць, викликаючи алостеричні й кооперативні ефекти.

Зв’язування ліганда L мономерним білком Е здійснюється за схемою

(4.103)

де К – константа асоціації. В умовах рівноваги

. (4.104)

Уводиться параметр Y  ступінь насичення білка лігандом, тобто відношення кількості зв’язуючих центрів, які зайняті лігандом за даної концентрації [L], до загальної кількості зв’язуючих центрів:

. (4.105)

Підставивши [EL] з (4.104), отримуємо

(4.106)

Вираз (4.106) нагадує рівняння Міхаеліса–Ментен (4.68) і представляє ізотерму Ленгмюра. Експериментально виміряна ступінь насичення Y міоглобіну залежно від концентрації кисню описується рівнянням (4.106) (рис. 4.37, крива 1).

На відміну від міоглобіну, ступінь насичення Y гемоглобіну киснем описується S-подібною кривою (рис. 4.37, крива 2). Така залежність для гемоглобіну добре описується рівнянням Хілла (1910)

, (4.107)

де h – коеффіцієнт Хілла. Перетворимо (4.107) таким чином:

. (4.108)

Прологарифмуємо (4.108) і отримаємо лінійну залежність від (графік Хілла) (рис. 4.39):

. (4.109)

З графіка Хілла легко визначаються два параметри – K i h. Коеффіцієнт Хілла h широко використовується як параметр, який характеризує ступінь кооперативності. Якщо h = 1, кооперативність відсутня, тоді приходимо до (4.106). Якщо h > 1, тоді спостерігається позитивна кооперативність. Для гемоглобіну h = 2,8. Чим більше h, тим вища кооперативність. У гемоглобіні зв’язування молекули О₂ з одним з гемів полегшує таке зв’язування О₂ з іншими гем-групами. Якщо h < 1, спостерігається негативна кооперативність.

Рис. 4.39. Графік Хілла

Для пояснення функціонування алостеричних ферментів запропоновані дві моделі.

Симетрична (алостерична) модель Моно–Уаймена–Шанже (1965). Розглянемо тетрамерний алостеричний білок, який складається із чотирьох субодиниць. У симетричній моделі постулюється, що субодиниці алостеричного ферменту можуть перебувати у двох конформаціях – напруженій (Т-стан) і релаксованій (Р-стан) (рис. 4.40, а).

Рис. 40. Моделі фунціонування алостеричних ферментів: а – симетрична модель; б – послідовна модель; Р і Т – релаксований і напружений стан ферменту

У субодиниці білка завжди мають одинакову конформацію. У рівновазі алостеричний білок перебуває у двох конформаціях: у Т-стані з низькою спорідненістю до ліганду L, й у Р-стані з високою спорідненістю до L. За відсутності L рівновага змішена в напрямку напруженої конформації, й переважає Т-стан ферменту. Коли L зв’язується з тетрамером, рівновага швидко зсувається в Р-стан ферменту. За цією моделлю перехід з Т- в Р-стан відбувається узгоджено, тобто конформація всіх субодиниць змінюється одночасно. Ця модель добре пояснює S-подібні криві.

Послідовна модель Кошланда–Неметі–Філмера (1966). Суттєвою особливістю цієї моделі є припущення про те, що зв’язування ліганду спричинює кілька послідовних структурних змін в алостеричному білку. Зв’язування L з першою субодиницею індукує в ній конформаційні зміни, які передаються на сусідню субодиницю. Індукована у другій субодиниці конформаційна зміна забезпечує більш легке зв’язування другої молекули L (рис.4.40, б). Після зв’язування другої молекули L продовжується вплив на конформацію інших субодиниць. Отже, конформаційні зміни відбуваються послідовно, через кілька проміжних станів з більшою чи меншою константою асоціації. Послідовна модель має перевагу в тому, що вона може пояснити негативну кооперативність: зв’язування першої молекули L індукує таку конформаційну зміну субодиниці, за якої значно полегшується зв’язування іншої L.

Розділ 5.