2.3.2. Методы культивирования микроорганизмов

(В.Н. Голубев «Пищевая БТ»)

Культивирование продуцента обычно называют ферментацией. Различают следующие виды аэробной и анаэробной ферментации: глубинная, поверхностная, периодическая, непрерывная, с иммобилизованным продуцентом и др. (рис. 5).

Рис. 5. Методы ферментации

В росте клеток микроорганизмов различных видов имеются различия (табл. 5).

Таблица 5.

Рост и размножение микроорганизмов

Наименование	Тип размножения	Схема размножения	Примечание
Бактерии	Деление	о о О о	Обе дочерние клетки одинаковы
Дрожжи	Почкование	о  о О  8  о  о	Дочерняя клетка Материнская клетка со «шрамом»
Мицелиальные грибы	Удлинение и разветвление мицелия	   	Удлинение, разветвление

8

Основные показатели процесса ферментации

Для оценки реального ферментационного процесса используют ряд кинетических показателей (табл. 6). Практически в ферментационной среде контролируют содержание основных субстратов S (обычно источник углеводов), биомассы X и целевого продукта Р. По этим показателям вычисляют удельную скорость роста , продуктивность системы по биомассе Q_X и продукту Q_P, а также, при необходимости, экономические коэффициенты.

• удельная скорость роста:

 = X₁ – X₀

X₁ (t_{1 –} t₀)

• продуктивность системы по биомассе Q_X:

Q_X = X₁ – X₀

t_{1 –} t_o

• продуктивность системы по продукту Q_P:

Q_P = P₁ – P₀

t_{1 –} t₀

Рост культуры можно охарактеризовать временем удвоения количества клеток или биомассы. Однако эти величины могут различаться, так как биомасса может увеличиваться и без деления клеток Если в данных условиях культивирования время удвоения биомассы и числа клеток не различается, значит, рост культуры происходит согласно экспоненциальной зависимости:

dx/dt = x или dN/dt = N

где N - количество клеток в I л среды;  - удельная скорость роста, 1/ч .

Время, необходимое для удвоения массы

t_d = ln2/  = 0,693/ 

Размножение вирусов и фагов идет значительно быстрее, чем рост клеток, так как репликация происходит за счет ресурсов клетки хозяина.

Методы обнаружения и выделения микроорганизмов

Обнаружение и выделение микроорганизмов производят при помощи питательных сред трех видов: специальных, элективных и дифференциально-диагностических.

1. Специальные питательные среды используют для выявления свойств бактерий. Эти сложные питательные среды включают дополнительные компоненты - сыворотку крови (сывороточный агар), кровь (кровяной агар), сахар (сахарный бульон) и т.д. Например, на кровяном агаре бактерии, продуцирующие гемолизин, образуют колонии с зоной гемолиза.

2. Элективные (избирательные) среды используют для выделения определенных видов бактерий. Например, элективной средой для стафилококков является желточно-солевой агар (ЖСА), для холерного вибриона - щелочной мясо-пептонный агар (МПА), для дифтерийной палочки - свернутая сыворотка.

Для выделения некоторых бактерий, рост которых может подавляться сопутствующими микробами, используют среды обогащения. Так, для выделения сальмонелл и шигелл из фекалий применяют селенитовый бульон, подавляющий рост сопутствующей микрофлоры — кишечной палочки.

3. Дифференциально-диагностические среды предназначены для дифференцирования бактерий (Гисса, Эндо, Левина, Плоскирева и др.). Они содержат индикатор, меняющий свой цвет при изменении рН в результате расщепления ферментами углеводов питательных сред.

Имеются питательные среды, сочетающие свойства дифференциально-диагностических и других питательных сред. Так, с помощью среды Плоскирева (как и среды Эндо) можно отличить кишечную палочку от дизентерийной по их действию на лактозу. Кишечная палочка, расщепляя лактозу с кислотообразованием, при росте дает колонии красного цвета (цвет индикатора) в отличие от дизентерийной палочки, не расщепляющей лактозу.

Наличие же в среде Плоскирева солей желчных кислот способствует преимущественному росту дизентерийной палочки, а бриллиантового зеленого — ведет к подавлению сопутствующих грамположительных бактерий.

Большинство патогенных и условно-патогенных бактерий растет в термостате при температуре 37 °С. Рост на питательных средах обычно учитывают через сутки после посева. Рост некоторых возбудителей (туберкулеза, бруцеллеза) становится видимым через 15—30 дней. Скорость роста бактерий зависит от их биологических свойств и условий культивирования (температура, наличие или отсутствие кислорода, углекислого газа, давление и др.). Аэрация способствует ускоренному росту аэробов. С этой целью используют шюттель-аппараты («встряхиватели»). Для культивирования анаэробов применяют специальные пита­тельные среды (среда Китта—Тароцци, тиогликолевая среда, связывающие кислород), которые перед посевом кипятят для удаления растворенного кислорода.

Применяют также физические, химические и биологические методы культивирования анаэробов. Физический метод заключается в удалении из аппарата или эксикатора воздуха и замене его газовой бескислородной смесью. Химический метод основан на применении химических поглотителей кислорода. Биологический метод Фортнера предусматривает одновременный посев на одну половину чашки Петри аэробных и на Другую половину — анаэробных бактерий, после чего чашку с посевом герметизируют парафином. При этом аэробы, используя при своем росте кислород, создают условия для дальнейшего роста анаэробов.

Выросшие на питательных средах бактерии идентифицируют по типу колоний на твердых питательных средах и характеру роста на жидких питательных средах. На жидких средах бактерии образуют пленку на поверхности среды, наблюдается придонный рост или равномерное помутнение среды.

Выделение чистых культур бактерий

Объекты окружающей среды, включая и материал от больного (гной, мокрота, фекалии и др.), обычно содержат смесь различных микробов. С целью их обнаружения и определения видовой принадлежности (идентификации) применяют бактериологическое исследование (бактериологический метод), которое заключается в посеве проб исследуемого материала на питательные среды для получения (выделения) чистой культуры.

Для выделения чистой культуры, которое производят поэтапно в течение нескольких дней, в начале его используют механическое разобщение бактерий на плотных питательных средах (посев штрихом, шпателем на несколько чашек Петри и др.). На следующий день получают отдельные изолированные колонии. Колония - скопление бактерий, ведущее начало от одной клетки, а поэтому представляющее собой чистую культуру.

После описания культуральных свойств различных типов колоний (размер, цвет, форма, края и др.), выросших на чашке с плотной питательной средой, делают пересев из каждого типа колоний на скошенный агар для накопления чистой культуры. Выросшую на 3-й день чистую культуру (после проверки ее чистоты путем микроскопирования) начинают идентифицировать по различным свойствам — морфологическим, тинкториальным, ферментативным, антигенным и др.

Существуют способы выделения чистых культур, основанные на обработке исследуемого материала с помощью физических или химических факторов, обладающих избирательным действием на определенные бактерии. Для выделения чистых культур используют также способность некоторых бактерий быстро размножаться в организме восприимчивых к ним лабораторных животных.

При выделении чистых культур анаэробов посевы исследуемого материала производят в анаэробных условиях на специальные среды с пониженным редокс-потенциалом, а также используют специальные аппараты (например, анаэростаты), исключающие доступ свободного кислорода к растущей культуре.

Лекция 7