Тема 6.1. Понятие генетической инженерии

Генетическая инженерия - ветвь молекулярной генетики, исследующая возможности и способы создания лабораторным путем (in vitro) генетических структур и наследственно измененных организмов, т. е. создания искусственных генетических программ, с помощью которых направленно конструируются молекулярные генетические системы вне организма с последующим их введением в живой организм.

Обычно употребляют два названия данного научного направления - генетическая инженерия и генная инженерия, являющиеся как бы синонимами. Однако их смысловое содержание неодинаково: генетическую инженерию связывают с генетикой, а генная - имеет отношение только к генам.

Основная задача генетических программ - создание in vitro молекул ДНК посредством соединения фрагментов ДНК, которые в естественных условиях не сочетаются благодаря межвидовым барьерам (рекомбинантные ДНК).

Молекула рекомбинантной ДНК представляет собой соединенные в бесклеточной системе два компонента: вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии, и фрагмент клонируемой («чужеродной») ДНК, содержащий интересующие исследователя генетические элементы. Согласно определению национальных институтов здоровья США, «рекомбинантными ДНК называют молекулы ДНК, полученные вне живой клетки путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироваться в клетке».

Использование методов генной инженерии позволяет увеличивать производство сельскохозяйственной продукции. Модификация генома сельскохозяйственных растений придает им устойчивость к болезням, вредителям, пестицидам, неблагоприятному климату, улучшает агротехнические свойства культур и способствует значительному увеличению урожайности. Сегодня уже возможно создание трансгенных растений с заданными лечебными свойствами (в Центре «Биоинженерия» РАН получен рис с повышенным содержанием железа, ведутся работы над созданием растения с повышенным содержанием витамина В₂).

По мнению ряда специалистов, трансгенные растения представляют собой экономически выгодную альтернативу другим системам экспрессии генов, кодирующую «полезные» белковые продукты. Достижения в технологии рекомбинантных ДНК сделали возможным использование растений в качестве «фабрик» («plant-fabric») по производству «целевых» белков, липидов, углеводов, используемых не только в качестве продуктов питания, но и в качестве фармацевтических препаратов, красителей, пигментов, масел и полимеров.

В последнее время в ряде экономически развитых стран возросло производство и оборот пищевых продуктов, полученных из генетически модифицированных источников. В США, Канаде, Аргентине, Китае и Японии, являющихся мировыми лидерами в выращивании трансгенных культур растений, созданы для использования в питании населения несколько десятков таких культур, среди них соя, картофель, кукуруза, сахарная свекла, томаты, тыква, рапс и др. Трансгенным картофелем в США засеяно около 90 тыс. га (для сравнения - в Канаде засеяно лишь 4 тыс. га). Американские фермеры поставляют на мировой рынок 77,7 млн тонн в год генетически измененной сои. Ежегодно в мире проходят полевые испытания более 4 000 генетически модифицированных культур, производство некоторых из них достигает промышленных объемов. В 2001 г. из 52,6 млн га, занятых генетически модифицированными растениями, 63 % посевных площадей занимала соя, 19 % - кукуруза, 13 % - хлопок, 5 % - рапс и другие культуры. Уже 60 % производимой в мире сои, 15 % картофеля, 7 % кукурузы являются генетически модифицированными.

Продукты, произведенные из трансгенных растений, составляют сейчас заметную долю в рационах жителей США. В традиционных для этой страны продуктах питания используется генно-модифицированные картофель и говядина, помидоры и соя, рапс и молоко, хлопок и кукуруза. Причем некоторые продукты и блюда уже полностью могут быть изготовлены с применением технологий генной инженерии (гамбургеры, салаты, картофель-фри и другие). Американцы потребляют 90 % всего трансгенного картофеля, производимого в мире. В России посевов трансгенных культур для коммерческого применения пока нет; существуют лишь закрытые экспериментальные поля при различных исследовательских центрах. Так, по данным UNIDO (Организация по индустриальному развитию) и ОЕСD (Организация по экономическому сотрудничеству) в РФ существуют посадки генетически модифицированных культур картофеля (Москва, Московская обл., Тамбов, Краснодар, Дальний Восток), сои (Краснодарский край), сахарной свеклы (Московская обл., Тамбов, Краснодар, Дальний Восток), кукурузы (Московская обл., Тамбов, Краснодарский край, Дальний Восток) - с целью испытаний их на биобезопасность; трансгенного картофеля (в 18 регионах) - с целью сортоиспытания, а сахарной свеклы и сои (Московская область и другие территории) - с целью переработки и употребления.

В связи с отсутствием в России моратория на ввоз из-за рубежа трансгенной пищевой продукции она поступает на российский продовольственный рынок. Более того, если в конце 90-х годов прошлого века в России случаи использования импортных генетически модифицированных источников при производстве продуктов питания были единичными, то в настоящее время объем и темпы их использования многократно увеличились. Российский рынок таких продуктов превышает 1 млрд. $, только ежегодный импорт трансгенной пищевой продукции оценивается в 650 млн. долларов. По некоторым оценкам официальных лиц, в Россию в 2002 году было ввезено 350 - 400 тыс. тонн модифицированной сои и около 30 тыс. тонн кукурузы. Данные Государственного таможенного комитета РФ подтверждают, что за последние три года ввоз трансгенной сои из США увеличился на 100 %.

93

В настоящее время в России прошли полный цикл всех необходимых исследований и разрешены для использования в пищевой промышленности и реализации населению 11 видов пищевой продукции растительного происхождения, полученных с применением трансгенных технологий: 3 линии сои, устойчивых к пестицидам, 3 линии кукурузы, устойчивые к пестицидам, 2 линии кукурузы, устойчивые к вредителям, 2 сорта картофеля, устойчивых к колорадскому жуку и 1 линия сахарной свеклы, устойчивой к глифосату (табл. 29).

В соответствии с Постановлением главного государственного санитарного врача РФ № 149 от 16.09.2003 г. «О проведении микробиологической и молекулярно-генетической экспертизы генетически модифицированных микроорганизмов, используемых в производстве пищевых продуктов» санитарно-эпидемиологической экспертизе в ГУ НИИ питания РАМН и ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН также подлежит следующая продукция, полученная с использованием генетически модифицированных микроорганизмов:

1. Сыры, полученные с использованием дрожжевых затравок, экспрессирующих рекомбинантный химозин.

2. Пиво, полученное с использованием генетически модифицированных дрожжей.

3. Молочная продукция, полученная с использованием «стартерных» культур.

4. Копченые колбасы, полученные с использованием «стартерных» культур.

5. Пищевые продукты, технология приготовления которых пре­дусматривает использование кисломолочных бактерий-продуцентов ферментов.

6. Пробиотики, содержащие генетически модифицированные штаммы.

Понятие клеточной инженерии

Клеточная инженерия - одно из наиболее важных направлений в биотехнологии. Она основана на использовании принципиально нового объекта - изолированной культуры клеток или тканей эукариотических организмов, а также на тотипотентности - уникальном свойстве растительных клеток - способности любой соматической клетки полностью реализовывать свой потенциал развития. Иначе говоря, о способности каждой растительной клетки давать начало целому организму.

Применение этого объекта раскрыло большие возможности в решении глобальных теоретических и практических задач.

В области фундаментальных наук стало осуществимым исследование таких сложных проблем, как взаимодействие клеток в тканях, клеточная дифференцировка, морфогенез, реализация тотипотентности клеток, механизмы появления раковых клеток и др.

При решении практических задач основное внимание уделяется вопросам селекции, получения значительных количеств биологически ценных метаболитов растительного происхождения, в частности более дешевых лекарств, а также выращивания оздоровленных безвирусных растений, их клонального размножения и др.

Бурное развитие клеточной инженерии приходится на 50-е годы прошлого века, хотя первые попытки выращивания изолированных кусочков ткани были сделаны гораздо раньше. В конце XIX - начале XX в. немецкие ученые X. Фехтинг (1892), С. Рехингер (1893), Дж. Хаберландт (1902) сделали первую неудачную попытку стимуляции роста растительных тканей и органов, помещенных на фильтровальную бумагу, пропитанную сахарозой. Несмотря на отсутствие положительного результата, их работы представляют большой интерес. В них были высказаны идеи, которые намного опередили развитие науки того времени и которые нашли свое подтверждение несколько десятилетий спустя. Так, Фехтинг предположил, что полярность присуща не только организму или органу растения, но и самой клетке. Рехингер определил минимальный размер сегмента, образующего каллус. Согласно его исследованиям, в кусочках ткани тоньше 1,5 - 2,0 мм клетки не делились. Хаберландт впервые четко сформулировал идеи о возможности культивирования in vitro изолированных клеток растений и о тотипотентности клеток.

Первые успехи были получены в 1922 г. американским ученым В. Роббинсом и немецким ученым В. Котте. Независимо друг от друга они показали возможность выращивания меристем кончиков корней томатов и кукурузы на синтетической питательной среде. Считается, что их работы легли в основу метода культуры изолированных корней растения.

Настоящее развитие метода культуры тканей и клеток высших растений началось в 1932 г. с работ французского ученого Р. Готре и американского исследователя Ф. Уайта. Они показали, что при периодической пересадке на свежую питательную среду кончики корней могут расти неограниченно долго. Кроме того, ими были разработаны методы культивирования новых объектов: тканей древесных растений камбиального происхождения, каллусных тканей запасающей паренхимы (Р. Готре), а также тканей растительных опухолей (Ф.Уайт). С этого момента начинаются массовые исследования по разработке новых питательных сред, включающих даже такие неконтролируемые компоненты, как березо­вый сок или эндосперм кокоса, и по введению в культуру новых объектов. К 1959 г. насчитывалось уже 142 вида высших растений, выращиваемых в стерильной культуре.

В 1955 г. после открытия Ф. Скугом и С. Миллером нового класса фитогормонов - цитокининов - оказалось, что при совместном их действии с другим классом фитогормонов - ауксинами - появилась возможность стимулировать деление клеток, поддерживать рост каллусной ткани, индуцировать морфогенез в контролируемых условиях.

В 1959 г. был предложен метод выращивания больших масс клеточных суспензий. Важным событием стала разработка Е. Коккингом (Ноттингемский университет, Великобритания) в 1960 г. метода получения изолированных протопластов. Это послужило толчком к получению соматических гибридов, введению в протопласты вирусных РНК, клеточных органелл, клеток прокариот. В это же время Дж. Морелом и Р. Г. Бутенко был предложен метод клонального микроразмножения, который сразу же нашел широкое практическое применение.

Весьма важным достижением в развитии технологий культивирования изолированных тканей и клеток стало культивирование одиночной клетки с помощью ткани-«няньки». Этот метод был разработан в России в 1969 г. в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН под руководством Р. Г. Бутенко. В последние десятилетия продолжается быстрый прогресс технологий клеточной инженерии, позволяющих значительно облегчить селекционную работу. Большие успехи достигнуты в развитии методов получения трансгенных растений, технологий использования изолированных тканей и клеток травянистых растений, начато культивирование тканей древесных растений.

Основные операции генетической инженерии. Матричный синтез. Рекомбинация. Гибридизация. Молекулярное клонирование

Генетическая (генная) инженерия – это раздел экспериментальной молекулярной биологии. Главным объектом генно-инженерного воздействия является дезоксирибонуклеиновая кислота. Сущность генетической инженерии состоит в целенаправленной перестройке генетического аппарата (генома) клеток для изменения их генетических характеристик. Важнейшими предпосылками генетической инженерии явились следующие открытия. Были установлены молекулярные механизмы матричного синтеза: ДНК ® ДНК (репликация), ДНК ® РНК (транскрипция), мРНК ® белок (трансляция), а также обмена генами у гомологичных хромосом при половом процессе (рекомбинация). Кроме того, было показано, что а) вирусы, паразитирующие в бактериях (фаги), встраивают свою ДНК в геном бактерии, б) в бактериях, невосприимчивых к заражению фагами, содержатся специальные ферменты, которые разрезают двойные спирали фаговых ДНК в строго определенных местах. Эти ферменты были названы рестриктазами. В настоящее время получены сотни рестриктаз. В основу их классификации положена потребность фермента в кофакторах и характер расщепления ДНК. Следующее важное открытие, предопределившее возникновение генетической инженерии – обнаружение в бактериальных клетках внехромосомных маленьких кольцевых молекул ДНК, которые, так же как и хромосомные ДНК, несут в себе генетическую информацию. Эти минихромосомы были названы плазмидами. Очень важно, что плазмиды из-за своих маленьких размеров могут быть выделены из клетки в неповрежденном состоянии.

Процесс рекомбинации в организме (in vivo) возможен в большинстве случаев между гомологичными молекулами ДНК. Однако вне организма (in vitro) притягивание и взаимодействие (гибридизация) молекул ДНК возможны, если они будут иметь небольшие комплементарные односпиральные участки из четырех и более нуклеотидов на концах молекулы. Такие участки получили название липких концов, так как две молекулы ДНК могут соединиться этими концами. Следовательно, рекомбинация возможна, даже если структура молекул ДНК будет очень сильно различаться. Для получения гетерогенных молекул ДНК с одинаковыми липкими концами используются ферменты-рестриктазы. Они разрезают молекулы ДНК в участках, несущих повторяющиеся последовательности нуклеотидов. Поскольку рестриктазы разрезают ДНК в точках повтора, конец одной молекулы оказывается комплементарным (липким) концом другой молекулы. В дальнейших операциях используют плазмиды. Для получения односпиральных концов, комплементарных концам генов, их тоже режут рестриктазами и проводят гибридизацию гена и плазмиды в пробирке. Затем рекомбинантную или химерную плазмиду вводят в клетку. Использующиеся в генной инженерии плазмиды имеют маркерный ген, делающий клетку устойчивой к определенному антибиотику, что способствует отделению клеток с рекомбинантной плазмидой от других клеток. Для этого бактерии высевают на среду с антибиотиком, на которой растут только клетки с плазмидой (рекомбинантные клетки). Процедура их отбора называется молекулярным клонированием, так как рекомбинантные клетки представляют собой потомство одной молекулы. Таким образом, в бактериальную клетку можно ввести ген, полученный из любого организма, и заставить чужеродный ген там функционировать.

Итак, основными операциями генной инженерии являются следующие:

1. рекомбинация in vitro ДНК-вектора и ДНК-гена;

1. введение рекомбинантной плазмиды в клетку;

2. молекулярное клонирование.

Выдающиеся достижения генной инженерии нашли многочисленные практические применения, особенно в медицине и растениеводстве. Среди наиболее значительных достижений – получение человеческого инсулина в промышленных масштабах. Этот белок относится к гормонам, т.е. к веществам, играющим роль сигналов, посылаемых в определенных физиологических состояниях организма к соответствующим органам – мишеням. Инсулин вырабатывается поджелудочной железой и способствует усвоению углеводов, в первую очередь глюкозы. Нарушения в синтезе инсулина вызывают тяжелое и весьма распространенное заболевание – сахарный диабет, при развитых формах которого необходимо ежедневно вводить в организм этот гормон. Инсулин давно получают из органов животных и используют в медицине. Однако длительное применение животного инсулина приводит к необратимому поражению многих органов пациента из-за иммунологических реакций, вызываемых инъекцией чужеродного человеческому организму белка. Необходимо заменить животный инсулин человеческим. В качестве первой практической задачи было решено клонировать ген инсулина. Клонированные гены человеческого инсулина были введены с плазмидой в бактериальную клетку, где синтезировался гормон, который природные микроорганизмы никогда не синтезировали. Таким образом была решена проблема получения человеческого инсулина. Параллельно была решена проблема иммунологического поражения организма животным инсулином. Производство и продажу инсулина впервые начала американская фирма Eli Lilly. Ежегодное потребление его составляет около 2500 кг. Генноинженерными методами получают также другие важные медицинские препараты – интерферон, использующийся при лечении различных вирусных заболеваний и злокачественных новообразований, и противораковый препарат интерлейкин. В настоящее время около 200 новых диагностических препаратов уже введены в медицинскую практику, и более 100 генноинженерных лекарственных веществ находятся на стадии клинического изучения.

Генетическая инженерия сводится по существу к процессу получения рекомбинантных ДНК, содержащих, помимо присущего «хозяйской» ДНК набора природных генов, «чужой» ген или гены, взятые из другой ДНК. Метод получения рекомбинантных ДНК состоит из нескольких этапов:

а) выделение ДНК из клеток организма (получение генетического материала);

б) получение гибридных (рекомбинантных) молекул ДНК путем встройки в исходную ДНК «чужого» гена, выделенного из другой ДНК или полученного химическим синтезом;

в) введение рекомбинантной ДНК в живую клетку (бактерий, дрожжей, растительных или животных клеток, клеток человека);

г) создание условий для проявления (экспрессии) генов рекомбинантной ДНК в живой клетке и секреции нового продуцента, кодируемого «чужим» геном.

На рис.6.1 показана схема получения рекомбинантных ДНК и рекомбинантных штаммов микробов. Из рис.6.1 видно, что клонированный (т.е. выделенный из ДНК клетки) природный или химически синтезированный ген целевого продукта (например, инсулина, интерферона) встраивается в ДНК (например, в плазмиду какой-либо бактерии или в ДНК вируса) после расщепления ДНК с помощью ферментов рестриктаз. Вставленный в расщепленную ДНК ген «сшивается» с этой ДНК с помощью ферментов лигаз. Полученная рекомбинантная ДНК бактерий или вируса затем вводится в эту же микробную клетку или вирусную частицу, из которой была взята, и таким обра­зом получают рекомбина'нтный штамм бактерий или вирусов.

-

Рис. 1. Получение рекомбинантных ДНК и рекомбинантных штаммов микроорганизмов (генетическая инженерия)

При культивировании рекомбинантного штамма в процессе роста и размножения этот штамм синтезирует не свойственный ему продукт, кодируемый встроенным чужеродным геном (на­пример, инсулин, интерферон).

На этом принципе в настоящее время получены сотни рекомбинантных штаммов бактерий, дрожжей, вирусов, способных продуцировать разнообразные биологически активные вещества: антигены, антитела, ферменты, гормоны, иммуномодуляторы и др. Технология получения биологически активных веществ, основанная на применении рекомбинантных штаммов по существу не отличается от типовой биотехнологической схемы. Она сводится к культивированию рекомбинантного штамма, выделению синтезируемого штаммом целевого продукта, его очи­стке и концентрированию и созданию конечной формы препарата.

В настоящее время уже разработаны сотни медицинских препаратов, полученных на основе генетической инженерии. Многие из них внедрены в практику и применяются в медицине. Это гормоны (инсулин и гормон роста человека), антикоагулянты и тромболитики (тканевой активатор плазминогена, факторы VIII и IX), вакцины («дрожжевая» вакцина против гепатита В), иммуномодуляторы (интерфероны а, р и у, интерлейкины 1, 2 и др., фактор некроза опухолей, пептиды тимуса, миелопептиды), ферменты (уреаза), ангиогенин, диагностические препараты (на ВИЧ-инфекцию, на вирусные гепатиты и др.), моноклопальные антитела, колониестимулирующие факторы (макрофагальный, гранулоцитарный и др.), а также многие биологически активные пептиды.

Применение генетической инженерии в биотехнологии оправдано в тех случаях, когда: а) нужное вещество невозможно получить никаким другим способом; б) если технология эффективнее и экономичнее традиционной или в) если она более безопасна для человека и окружающей среды. Например, анти­гены для создания вакцин против некультивируемых микроорганизмов (плазмодий малярии, возбудитель сифилиса) можно получить только генно-инженерным способом. Генно-инженерный интерферон превосходит по активности интерферон, полученный из лейкоцитов крови, и значительно дешевле последнего. Приготовление препаратов из антигенов возбудителей особо опасных инфекций (чума, холера) можно заменить биосинтезом их рекомбинантными штаммами непатогенных бактерий.

Генетическая инженерия возникла на стыке многих биологических дисциплин: молекулярной генетики, энзимологии, биохимии нуклеиновых кислот и др. Первая реком-бинантная ДНК получена в 1972 г. (П.Бергом с сотр.) и была составлена из фрагмента ДНК обезьяньего вируса ОВ40 и бактериофага λ dvgal с галактозным опероном Е. соli. Формально 1972 г. следует считать датой рождения генетической инженерии.

Генетическая инженерия имеет яркую историю благодаря тому общественному резонансу, который она вызвала с самых первых своих шагов. Начало этим событиям положило послание участников Гордоновской конференции (1973) президиуму АН США, в котором говорилось о возможной опасности технологий рекомби-нантных ДНК для здоровья человека. Возможные блага генетической инженерии признавались с самого начала, но разногласия по данной проблеме не затихли и сейчас. В табл. 5.1 перечислены основные этапы становления и развития генетической инженерии.

Основные операции генетической инженерии. Рекомбинация

Технология рекомбинантных ДНК включает набор как новых методов, так и заимствованных из других дисциплин, в частности из генетики микроорганизмов. Эти методы существенно расширяют возможности генетических исследований. Используя технологию рекомбинантных ДНК, получают даже минорные клеточные белки в больших количествах и проводят тонкие биохимические исследования структуры и функций белков, а также осуществляют детальный химический анализ генетического материала.

К наиболее важным методам биотехнологии рекомбинантных ДНК относятся следующие:

1. Специфическое расщепление ДНК рестрикцирующими нук-леазами, что в значительной степени ускоряет выделение различных генов и манипуляции с ними.

2. Быстрое секвенирование всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющее определить точные границы гена и кодируемую им аминокислотную последовательность полипептида.

3. Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая с большой точностью выявить специфические нуклеотидные последователь­ности на основе их способности связывать комплементарные ос­нования.

4. Клонирование ДНК, суть которого сводится к введению ДНК-фрагмента в самореплицирующийся генетический аппарат (плазми-ду или вирус), который используют для трансформации бактерий. Бактериальная клетка после трансформации способна воспроизводить этот фрагмент во многих миллионах идентичных копий.

5. Генетическая инженерия, позволяющая получать модифици рованные версии генов и затем внедрять их в клетки или организ мы.

Технология рекомбинантных ДНК оказала существенное воздействие на всю клеточную биологию, позволяя решать такие задачи, как определение строения и функций не только белков, но и индивидуальных доменов, а также расшифровывать механизмы регуляции экспрессии генов, получать многие белки, участвующие в регуляции обменных процессов, клеточной пролиферации и развитии организма.

Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей осуществляется особыми ферментами - рест-рикцирующими нуклеазами, способными разрушить чужеродную ДНК. Все ферменты условно можно разделить на следующие группы:

1) используемые для получения фрагментов ДНК;

2) синтезирующие фрагменты ДНК на матрице РНК;

3) соединяющие фрагменты ДНК;

4) позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК;

5) применяемые для приготовления гибридизационных проб.

Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК, опознает в ней специфическую последовательность из 4 - 6 нуклеотидов.

В настоящее время различные фирмы вы­пускают более 100 разнообразных ферментов, опознающих различные последовательности нуклеотидов.

Подавляющее большинство ферментов разрывает только двунитевую ДНК с образованием серии фрагментов, называемых рестрикционными (или рестриктами,) с тупыми либо липкими концами (рис. 5.1).

Многие рестриктазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещием

на несколько нуклеотидов и образованием на концах фрагмента коротких одноцепочечных участков. Они способны образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепочечным участком, полученным с помощью того же фермента (липкие концы). Липкие концы позволяют легко соединить два любых фрагмента ДНК в одно целое. Полученный фрагмент ДНК (любого происхождения) можно встроить в очищенную ДНК плазмиды или бактериального вируса.

Сравнение размеров фрагментов ДНК после обработки соот-ветствующего участка генома набором рестриктаз позволяет по­строить рестрикционную карту, отражающую расположение оп-ределенной последовательности нуклеотидов в данном участке. Сравнением таких карт можно оценить степень гомологии между отдельными генами (участками) без определения их нуклеотид-ной последовательности. Рестрикционные карты важны для кло-нирования ДНК, решения эволюционных и филогенетических за­дач.

Для успешного решения задач генетической инженерии очень важно быстро секвенировать (определить последовательность нук­леотидов) любые очищенные фрагменты ДНК. В настоящее время объем информации о последовательностях ДНК столь велик, что для хранения и анализа данных о фрагментах, целых геномах не­обходимы новые технологии и компьютерная техника.

Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК, опознает в ней специфическую последовательность из 4—6 ну­клеотидов.

108

В биотехнологии рекомбинантных ДНК обычно используют два различных метода секвенирования ДНК: химический и фермен­тативный. Оба метода чрезвычайно надежны, быстры в исполне­нии и результативны. Результаты секвенирования позволяют так­же на основе генетического кода определить аминокислотную пос­ледовательность белка в соответствии с нуклеотидной последо­вательностью в соответствующем гене. На рис. 5.2 представлена схема химического метода секвенирования ДНК. Исходный фраг-_Мент ДНК, меченный ³²Р по 5'-концу, подвергается специфи­ческому расщеплению по определенному нуклеотиду (например, д), в результате чего образуются радиоактивные фрагменты раз­ной длины, которые разделяются по размерам при гель-электро­форезе, а радиоактивные из них выявляются с помощью радиоавто­графии.

Обычно химическая процедура расщепления ДНК выполняет­ся одновременно для четырех одинаковых проб ДНК с использо­ванием химических агентов, расщепляющих ДНК по отдельным нуклеотидам (Т, С, С и А). Полученные образцы подвергают элек­трофорезу на параллельных дорожках одного геля, и по его ре­зультатам можно определить нуклеотидную последовательность ДНК (рис. 5.3).

Энзиматический метод секвенирования основан на энзиматичес-ком введении нуклеотида, терминирующего полинуклеотидную цепь (рис. 5.4). В этом случае обычно используют дидезоксирибо-нуклеозидтрифосфаты, в которых дезоксирибоза-З'-ОН, представ­ленная в нормальных нуклеотидах, отсутствует. Такой модифици­рованный нуклеотид, внедряясь в цепь ДНК с помощью ДНК-полимеразы, блокирует присоединение следующего нуклеотида. Синтез т у11;го молекулы ДНК в присутствии затравки (прайме-ра) и небольшого количества одного из таких модифицирован­ных нуклеотидов приводит к образованию фрагментов ДНК в виде «лесенки». Если для получения таких фрагментов применять мече­ную ДНК (обычно проводят четыре реакции синтеза с использо­ванием различных нуклеотидов, терминирующих цепь), а электро-форетический анализ проводить на четырех дорожках геля, то мож­но определить последовательность нуклеотидов. В настоящее вре­мя используют модифицированный метод, сводящийся к флуо­ресцентному анализу наборов фрагментов ДНК в процессе дви­жения по одной дорожке геля.

Важнейший метод получения рекомбинантных ДНК основан на способности нуклеиновых кислот быстро восстанавливать свою структуру после нагревания до 100 °С в сильно щелочной среде (РН 13). При нагревании до 100 °С комплементарные пары основа­ний разрушаются и ДНК диссоциирует на две раздельные цепи. Этот процесс назван денатурацией ДНК («плавлением»). Выдер-*ивание комплементарных цепей при температуре 65 °С приводит

109

к их спариванию и восстановлению структуры двойной спирали (гибридизация, ренатурация, или «отжиг»). Это свойство ДНК широко используют в химической систематике, а также для ре­шения эволюционных и филогенетических проблем.

Скорость восстановления (ренатурации) двойной спирали за­висит от вероятности столкновения двух комплементарных нук-леотидных последовательностей и их концентрации в растворе. Ско­рость реакции гибридизации можно использовать для определе­ния концентрации любых последовательностей РНК или ДНК в смеси, содержащей и другие фрагменты нуклеиновых кислот. Для этого необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный к тому фрагменту, который надлежит выявить. Обычно фрагмент ДНК, полученный клонированием либо хими­ческим путем, метят по ³²Р в целях прослеживания включения фрагмента в состав дуплексов при гибридизации. Одноцепочеч-

110

к их спариванию и восстановлению структуры двойной спирали (гибридизация, ренатурация, или «отжиг»). Это свойство ДНК широко используют в химической систематике, а также для ре­шения эволюционных и филогенетических проблем.

Скорость восстановления (ренатурации) двойной спирали за­висит от вероятности столкновения двух комплементарных нук-леотидных последовательностей и их концентрации в растворе. Ско­рость реакции гибридизации можно использовать для определе­ния концентрации любых последовательностей РНК или ДНК в смеси, содержащей и другие фрагменты нуклеиновых кислот. Для этого необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный к тому фрагменту, который надлежит выявить. Обычно фрагмент ДНК, полученный клонированием либо хими­ческим путем, метят по ³²Р в целях прослеживания включения фрагмента в состав дуплексов при гибридизации. Одноцепочеч-

110

ную молекулу ДНК, используемую в данном методе в качестве Меченого индикатора, называют ДНК-зондом. Размеры его варьи­руют от нескольких десятков до нескольких сотен и тысяч нукле-отидов. Реакция гибридизации с использованием ДНК-зондов позволяет идентифицировать нуклеотидные последовательности