Ферментативный катализ и основы кинетики ферментативных реакций

Тысячи различных ферментативных реакций протекают в клетке одновременно и согласованно. Такие реакции могут происходить лишь в тех случаях, когда ферменты способны «распознавать» свой субстрат. Это свойство во многом определяет упомянутый выше принцип «ключа и замка» или «руки и перчатки». На рис. 18 схематически показано, как фермент глюкозооксидаза на нескольких сахарах в среде «узнает» свой субстрат - глюкозу и кислород; как образуется фермент - субстратный комплекс из этих двух субстратов, а затем - продукты (глюконолактон и пероксид водорода). В этом случае можно говорить о высокой субстратной специфичности фермента. Однако столь высокая специфичность не всегда рациональна. Например, в пищеварительный тракт попадают различные белки, и чтобы для расщепления каждого из них не синтезировать свой специфический фермент, в процессе эволюции возникли менее специфичные ферменты, например, пепсин, который расщепляет все белки в местах соединения определенных аминокислот.

У простых ферментов типа лизоцима каталитическое действие осуществляется таким образом: фермент влияет на конформацию субстрата и переводит его в напряженное состояние, способствующее протеканию реакции. Кроме того, в активном центре сосредоточено много неполярных групп, и эта область действует как органический растворитель. Здесь находится небольшое число заряженных полярных боковых групп аминокислот, реакционная способность которых выше по сравнению с водной средой. Имея большую гибкую молекулу, ферменты способны сосредоточить на небольшом участке необходимые группы для осуществления конкретной реакции с субстратом.

У сложных ферментов, имеющих простатические группы и коферменты, возможности взаимодействия с субстратом увеличиваются. Так, каталаза, которая расщепляет пероксид водорода, имеет прочно связанную с активным центром простетическую группу, представляющую собой порфириновое кольцо с гемогруппой (железо) в центре. Во время катализа простетические группы расщепляются, а затем регенерируются.

Рис. 18. Схема распознавания ферментом субстрата, образования фермент-субстратного комплекса и катализ

Соединение фермента с субстратом в каталитическом центре может происходить с помощью водородных связей, при участии электронов или более слабых взаимодействий, например, сил Ван-дер-Ваальса. Все это означает, что фермент и субстрат в районе каталитического центра должны сблизится до расстояния 1,5-2 нм. В этих условиях внутренние связи в молекуле субстрата ослабляются.

Ферментативная реакция в целом состоит из трех последовательных стадий, а именно: образования фермент-субстратного комплекса; превращения этого комплекса в комплекс фермент - продукт и диссоциации промежуточного продукта.

Механизм действия ферментов состоит в снижении энергии активации, необходимой молекуле, чтобы вступить в реакцию. Согласно существующим теориям (промежуточных соединений, адсорбционной, цепных реакций) снижение энергии активации происходит в результате адсорбции реагирующих веществ на поверхности фермента с образованием промежуточного нестойкого соединения - фермент-субстратного комплекса, что вызывает глубокую деформацию разрываемой связи. При этом фермент является начальным, или «запальным», фактором реакции; в дальнейшем катализируемая им реакция идет уже самостоятельно. Это объясняет тот факт, что для ферментативной реакции достаточна незначительная концентрация энзима.

Таким образом, добавление катализатора позволяет молекулам преодолеть активационный барьер (рис. ) на более низком энергетическом уровне (способ «обходного» пути).

Рис. Характеристика энергетического состояния катализирцемой (1) и некатализируемой (2) реакции

При изучении каталитической активности ферментов необходимо основываться на количественной оценке скоростей катализируемых реакций. Изучение влияния различных факторов на скорость данной реакции позволяет сделать вывод о механизме действия ферментов и подобрать наилучшие условия для эффективного действия ферментов.

Влияние различных факторов на функционирование

ферментов

Факторы, определяющие характер течения ферментативных реакций: концентрации фермента и субстрата, рН, температура, наличие активаторов или ингибиторов.

1. Влияние концентрации фермента. При данных условиях две молекулы фермента, действующие в растворе независимо друг от друга, за определенный промежуток времени вызовут превращение в два раза большего количества субстрата, чем одна молекула. Поэтому скорость (v) реакции прямо пропорциональна концентрации фермента Е:'

v = kE

В большинстве случаев графически это можно представить в виде линейных зависимостей, широко используемых в методах определения концентрации ферментов (рис. ).

Иногда линейность графика нарушается, что обусловлено свойствами самого фермента или несовершенством методов опрееледеления активности.

2. Влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции базируется на теории Михаэлиса.

Фермент Е вначале образует со своим субстратом комплекс ЕS, который затем распадается с освобождением фермента и продуктов реакции:

k⁺¹ k⁺²

E + S ↔ ES  Е + Р

k^-1

Р – продукты реакции.

Представление об образовании фермент-субстратного комплекса является главным для всех современных концепций о механизме действия ферментов, которые объясняют закономерности изменения скорости ферментативной реакции.

При очень низких концентрациях субстрата скорость реакции очень мала, но постепенно возрастает по мере повышения концентрации субстрата.

Скорость, когда фермент «насыщен» субстратом, принимают за максимальную (v_maх). Однако сколько бы ни увеличивалась концентрация субстрата, скорость ферментативной реакции приближается к максимальной, но никогда не достигает ее. График зависимости между начальной скоростью реакции и концентрацией субстрата представляет собой часть равнобочной гиперболы (рис.).

Рис. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата

Эти исследования имеют и большое практическое значе­ние, так как позволяют подо­брать наилучшие условия для эффективного действия фер­ментов.

Гис. 3.3. Влияние концентрации

фермента на скорость реакции при

гидролизе коллагена:

' 1 — коллагеназой тканей; 2 — протосубтили-ном;3—пепсином

Факторы, определяющие ха­рактер течения ферментативных реакций, многочисленны и раз­нообразны. К главным из них относятся: концентрации фер­мента и субстрата, рН, темпера­тура, наличие активаторов или ингибиторов.

При данных условиях две мо­лекулы фермента, действующие в растворе независимо друг от друга, за определенный проме­жуток времени вызовут превра-

_ ————— ___., . -.^~^^1»

центрации фермента ([Е\)'.

щение в два раза большего количества субстрата, чем одна молеку­ ла. Поэтому скорость (v) реакции прямо пропорциональна кон­ ет '

у = ад (3.1)

В подавляющем большинстве случаев графически это можно представить в виде линейных зависимостей, широко используе­мых в методах определения концентрации ферментов (рис. 3.3).

Иногда линейность графика нарушается, что обусловлено свойствами самого фермента или несовершенством методов опре­еле

деления активности.

.

Влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции базируется на теории Михаэлиса.

Как правило, в ферментативных реакциях участвует не один, а большее число субстратов. Гидролазные реакции часто рассматри­вают как односубстратные, так как второй субстрат присутствует в очень высоких концентрациях и можно считать, что фермент по­стоянно насыщен водой.

сывается уравнением вида:

Рассматривая кинетику односубстратных реакций, следует подчеркнуть, что концентрация субстрата — один из наиболее важных факторов, определяющих скорость. Практически во всех случаях график зависимости между начальной скоростью и кон­центрацией субстрата представляет собой часть гиперболы и опи-

сывается УПЯКНРНИРМ ПМПЯ-

Фермент Е вначале образует со своим субстратом ^ комплекс Е5, который затем распадается с освобождением свободного фер­мента и продуктов реакции:

Представление об образовании фермент-субстратного комп­лекса является главным для всех современных концепций о меха­низме действия ферментов, которые объясняют закономерности изменения скорости ферментативной реакции.

При очень низких концентрациях субстрата скорость реакции весьма мала, но постепенно возрастает по мере повышения кон­центрации субстрата. В условиях возрастающих концентраций субстрата каждый раз приращение скорости становится все мень-16 и меньше до бесконечно малого ускорения.

Скорость, когда фермент «насыщен» субстратом, принято при-|нимать за максимальную (у_тах). В таком состоянии он не может функционировать быстрее.

Эффект насыщения свойствен почти всем ферментам. Одна­ко, сколько бы ни увеличивалась концентрация субстрата, факти­чески скорость ферментативной реакции приближается к макси­мальной, но никогда не достигает ее. Практически во всех случаях график зависимости между начальной скоростью реакции и кон­центрацией субстрата представляет собой часть равнобочной ги­перболы (рис. 3.4).

Благодаря тому что гипербола, изображенная на рис. 3.4, имеет •одинаковую форму для большинства ферментов, Михаэлис и Шентен в 1913г. определили константу, обозначаемую в настоя-

Рис. 3.4. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата

Благодаря тому, что гипербола имеет одинаковую форму для большинства ферментов, Михаэлис и Mентен в 1913г. определили константу, К_т, для обозначения соотношения между концентрацией субстрата и скоростью катализируемой ферментом реакции. Величина К_т означает концентрацию субстрата, при которой данный фермент обеспечивает скорость реакции, равную половине ее максимальной скорости. Физический смысл К_т фактически показывает степень сродства фермента и субстрата. Характерная форма кривой насыщения фермента субстратом может быть выражена математически уравнением Михаэлиса-Ментен:

v₀ = v_max [S] / (K_m + [S]),

где v₀ - начальная скорость реакции при концентрации субстрата [S]; v_max - максимальная скорость реакции; К_т - константа Михаэлиса - Ментен для данного фермента, соответствующая определенному субстрату.

Лекция 12

Ферментативная реакция состоит из трех последовательных стадий: образования фермент-субстратного комплекса; превращения этого комплекса в комплекс фермент - продукт и диссоциации промежуточного продукта.

Это уравнение было выведено исходя из предположения о том, что стадией, лимитирующей скорость ферментативных реакций, является распад комплекса ЕS на продукты распада и свободный фермент. Уравнение Михаэлиса - Ментен составляет основу для анализа кинетики всех ферментативных реакций. Если известны величины К_т и v_max, то можно рассчитать скорость ферментативной реакции при любой заданной концентрации субстрата. Уравнение позволит определить количественные характеристики ферментов и провести анализ их ингибирования.

Для определения v_max и К_т по данным измерений скорости при различных концентрациях субстрата график уравнения Михаэлиса - Ментен может быть построен несколькими способами. Чаще всего используют метод графического изображения по Лайнуиверу - Бэрку. Если построить график зависимости 1/v от 1/[S] и воспользоваться методом двойных обратных величин, то получится уравнение прямой линии вида:

1 ₌ K_m 1 ₊ 1

v₀ v_max [S] v_max

1/v

1/S

Прямая пересекает ось ординат в точке 1/ v_max под углом, равным K_m/ v_max .

Величина К_т - ключевое звено в уравнении Михаэлиса - Ментен. Она характеризует действие данного фермента по отношению к тому или иному субстрату при определенных значениях рН и температуры.

Следует отметить, что одни ферменты требуют довольно высоких концентраций субстрата для достижения скорости, равной половине максимальной, другим достаточно очень низких концентраций субстрата.

Ферменты активны только в определенном интервале рН; в большинстве случаев для каждого фермента имеется свой определенный оптимум рН.

Это объясняется несколькими причинами:

1) истинное обратимое влияние рН на скорость реакции v (когда фермент насыщен субстратом);

2) влияние рН на сродство фермента к субстрату (в этом случае падение активности по обе стороны от оптимума рН будет следствием понижения насыщения фермента субстратом в силу понижения сродства):

3) влияние рН на стабильность фермента, который может необратимо инактивироваться при рН пo одну или обе стороны от оптимума Перечисленные факторы могут действовать и в комбинации друг с другом. Например, падение активности по одну сторону от оптимума рН может быть результатом уменьшения сродства фермента к субстрату, а по другую - результатом инактивации фермента.

Для всех известных ферментов зависимость относительной скорости реакции от рН графически выражается в виде «колоколообразной» функции (рис. ).

Такие кривые строятся на основе данных, полученных при измерении начальных скоростей реакции, протекающей в буферных растворах с разными значениями рН.

Форма кривых, описывающих зависимость скорости ферментативной реакции от рН, отражает способность важных для данного фермента протон-донорных или протон-акцепторных групп в его каталитическом центре переходить при определенных значениях рН в состояние требуемой степени ионизации.

Рис. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН

Методы анализа температурных зависимостей кинетических и равновесных параметров ферментативных реакций основываются на классических принципах термодинамики и кинетики.

Такая форма зависимости отражает способность важных для данного фермента протон-донорных или протон-акцепторных групп в его каталитическом центре переходить при определенных значениях рН в состояние требуемой степени ионизации.

Зависимость скорости ферментативных реакций от температуры также имеет колоколообразную форму в достаточно широком температурном интервале (рис. ).

Рис. Влияние температуры на активность ферментов

Наличие температурного оптимума реакции объясняется наложением двух эффектов - возрастанием скорости реакции при увеличении температуры и ускорением тепловой денатурации белковой молекулы, приводящей к инактивации фермента при высоких температурах.

Таким образом, внешние факторы позволяют регулировать интересующие процессы, особенно при технологической обработке биологических объектов, например мяса и мясных продуктов.

Действие большинства ферментов можно также подавить или полностью ингибировать определенными химическими реагентами. Очевидно, химические вещества, в широком ассортименте присутствующие в биологических объектах (пищевом сырье), во многом предопределяют направленность и эффективность суммарных ферментативных превращений.

Известно много ферментов, для которых естественные условия их действия не совпадают с оптимальными параметрами рН и температуры. Изучение влияния ингибиторов ферментов позволяет получить ценные сведения о субстратной специфичности энзимов, природе функциональных групп активного центра и механизмах их каталитической активности. Ингибиторы ферментов служат очень полезными инструментами при исследовании метаболических путей в клетках.

Ферменты повышают скорости катализируемых ими реакций в 10⁸ - 10²⁰ раз. Необычайно высокое усиление каталитических свойств в мягких условиях объясняется следующими факторами:

1. Фермент способен связывать молекулу субстрата так, что атакуемая ферментом связь располагается вблизи от каталитической группы и правильно ориентирована по отношению к ней.

2. В результате присоединения субстрата возникает соответствие, благодаря которому комплекс ЕS легче достигает переходного состояния.

3. В активных центрах ферментов находятся специфические аминокислотные остатки, являющиеся хорошими донорами или акцепторами протонов. Они выступают мощными катализаторами органических реакций, протекающих в водных средах, а следовательно, имеют особое значение для гидролаз, действующих по схеме:

RХ + Н₂О RОН + НХ.

4. Катализируемая химическая реакция представляет тот специфический признак, по которому один фермент отличается от другого.

Механизм действия ферментов тесно связан со структурой и строением фермента и субстрата. Важную роль играет структура и строение белка, а именно: молекулярная масса, число пептидных цепей и последовательность аминокислот, упаковка и расположение пептидных цепей в молекуле фермента, число активных центров в молекуле белка, природа активного центра: химическая природа субстратсвязывающих и активизирующих групп, присутствующих в активном центре, а также небелковая часть, если она имеется.

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ

В 1971 г. на первой конференции по инженерной энзимологии был узаконен термин «иммобилизованные ферменты». Иммобилизованными ферментами называются ферменты, искусственно связанные с нерастворимым носителем, но сохраняющие свои каталитические свойства. Однако в понятие «иммобилизация» в настоящее время вкладывают более широкий смысл, чем связывание на нерастворимом носителе, а именно - полное или частичное ограничение свободы движения белковых молекул.

Еще в 1916 г. Дж. Нельсон и Е. Гриффин показали, что сахараза, сорбированная на угле, сохраняла свою каталитическую активность, но лишь в 1953 г. Н. Грубхофер и Д. Шлейт впервые осуществили ковалентные связывания амилазы, пепсина, РНКазы и карбоксипептидазы с нерастворимым носителем.

Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ по сравнению со свободными молекулами. Во-первых, такие ферменты, представляя собой гетерогенные катализаторы, легко отделяются от реакционной среды, могут использоваться многократно и обеспечивают непрерывность каталитического процесса. Кроме того, иммобилизация ведет к изменению свойств фермента: субстратной специфичности, устойчивости, зависимости активности от параметров среды. Иммобилизованные ферменты долговечны и в тысячи и десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов. Так, термоинактивация лактатдегидрогеназы (при температуре 65 °С), иммобилизованной в 60 %-м полиакриламидном геле, замедлена в 3600 раз по сравнению с нативным ферментом. Все перечисленное обеспечивает высокую экономичность, эффективность и конкурентоспособность технологий, использующих иммобилизованные ферменты.