20.Методы определения и единицы активности и количества фермента. Понятие об энзимопатологии, энзимодиагностике и энзимотерапии.

Для определения ферментативной активности используют следующие методы:

1. Химический метод – количественное определение субстрата или продуктов с помощью химических реагентов (О-гликозилгидролазы – по образованию восстанавливающих сахаров).

2. Спектрофотометрический метод – измерение скорости ферментативной реакции по изменению поглощения субстрата при характеристической длине волны (лиазы – по образованию двойной связи).

3. Манометрический метод – определение количества газа, выделяющегося в процессе реакции (оксидазы – по поглощению О2, декарбоксилазы – по выделению СО2).

4. Поляриметрический метод – фиксируется изменение оптического вращения (β-фруктофуранозидаза).

5. Хроматографический – количественное определение субстрата или продуктов с помощью различных видов хроматографии: бумажной (анализ сахаров), тонкослойной (гликозидов со сложными агликонами), ВЭЖХ (аминокислотный анализ и др.).

Удельная активность – это число единиц активности (Е) на мг белка.

Клиническая энзимология. Различают энзимопатологию, энзимодиагностику и энзимо терапию.

Энзимопатология это заболевания, которые обусловлены отсутствием или снижением ак тивности ферментов. В основном это – наследственные болезни, обусловленные генетиче скими нарушениями. Их называют молекулярными болезнями. Например:

• дефекты ферментов обмена фенилаланина возникают при снижении активности

фенилаланингидроксилазы (фенилпировиноградная олигофрения)

• дефект галактозо1фосфатуридилтрансферазы) галактоземия;

• дефекты ферментов обмена гликогена – гликогенозы;

• дефекты ферментов обмена липидов – липидозы, болезнь НиманаПика и др.

Энзимодиагностика это использование определения активности ферментов в биологиче ских жидкостях для выявления тех или иных заболеваний. Так, повышение активности ала нинаминотрансферазы и ЛДГ5 в сыворотке крови свидетельствует о поражении печени (гепатиты), повышение активности сывороточной аспартатаминотрансферазы и ЛДГ1 встреча ется при инфаркте миокарда, повышение активности амилазы в моче остром панкреатите. Энзимотерапия это использование ферментных препаратов для лечения заболеваний. Так, в качестве заместительной терапии при болезнях желудка назначают пепсин, для усиле ния переваривания пищи применяют ферменты поджелудочной железы (препараты фестал, мезим); для разжижения мокроты применяют ингаляции с трипсином; для рассасывания со единительнотканных рубцов – фермент гиалуронидазу; при растворения тромбов – фибри нолизин, стрептокиназа и др.

21. Изоферменты. Значение спектра изоферментов для диагностики заболеваний. Изменчивость изоферментов в онтогенезе(на примере ЛДГ)

Изоферменты – это изофункциональные белки. Они катализируют одну и ту же реакцию, но отличаются по некоторым функциональным свойствам в силу отличий по:

- аминокислотному составу;

- электрофоретической подвижности;

- молекулярной массе;

- кинетике ферментативных реакций;

- способу регуляции;

- стабильности и др.

Изоферменты – это молекулярные формы фермента, различия в аминокислотном составе обусловлены генетическими факторами.

Примеры изоферментов: глюкокиназа и гексокиназа.

Гексокиназа может фосфорилировать любой шестичленный цикл, гексокиназа – только превращение глюкозы. После приёма пищи, богатой глюкозой, глюкокиназа начинает работать. Гексокиназа – стационарный фермент. Он катализирует реакцию расщепления глюкозы при низких её концентрациях, поступающих в организм. Отличаются по локализации (глюкокиназа – в печени, гексокиназа – в мышцах и печени), физиологическому значению, константе Михаэльса.

Если фермент – олигомерный белок, то изоформы могут получаться в результате различной комбинации протомеров. Например, лактатдегидрогеназа состоит из 4-х субъединиц. Н – субъединицы сердечного типа, М – мышечного. Может быть 5 комбинаций этих субъединиц, а, следовательно, и 5 изоферментов: НННН (ЛДГ₁ – в сердечной мышце), НННМ (ЛДГ₂), ННММ (ЛДГ₃), НМММ (ЛДГ₄), ММММ (ЛДГ₅ – в печени и мышцах). [рис. эти 4 буквы в кружочки.

Надо отличать изоферменты от множественных форм ферментов. Множественные формы ферментов – это ферменты, которые получают свои различия уже после их синтеза, например фосфорилаза A и B.

Значение изоферментного спектра Анализ спектра изоферментов в количественном и качественном отношениях в разл. тканях и органах человека имеет большое значение для диагностики нек-рых заболеваний, в т. ч. и связанных с генетич. аномалиями. Напр., инфаркт миокарда сопровождается резким увеличением активности двух форм лактатдегидрогеназ - ₄ и ₄, причем эта аномалия сохраняется длит. время и может служить показателем течения болезни. Разл. формы гепатита сопровождаются изменениями спектров аспартатаминотрансферазы, малатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы и нек-рых др. ферментов. При диагностике ряда онкологич. заболеваний данные по анализу спектра изоферментов являются важным подтверждением диагноза и используются для прогноза метастазирования.

ЛДГ- лактатдегидрогеназа(в мышцах находится фермент этот)

анализ на ЛДГ входит в Биохимический анализ крови. Нормы:

• новорожденные — до 2000 Ед/л

• дети до 2 лет — 430 Ед/л

• дети от 2 до 12 — 295 Ед/л

• дети старше 12 лет и взрослые — 250 Ед/л

В ходе онтогенеза изменяется изоферментный спектр ЛДГ. В экстрактах из скелетных мышц 3–5-месячного эмбриона на долю изоферментов ЛДГ₃ и ЛДГ₂ приходится соответственно 40 и 31% от общей активности ЛДГ. В процессе эмбрионального развития в скелетной мускулатуре происходят постепенное возрастание активности катодных и снижение активности анодных изофер-ментов ЛДГ, так что у взрослых особей в скелетной мускулатуре наибольшей активностью обладают уже изоферменты ЛДГ₅ и ЛДГ₄. 22. Структурные компоненты нуклеиновых кислот. Биологическое значение и функции нуклеиновых кислот. История их изучения. Структура. Нуклеииновая кислоота (от лат. nucleus — ядро) — высокомолекулярное органическое соединение, полинуклеотид, образованный остатками нуклеотидов. Нуклеиновые кислоты ДНК и РНК присутствуют в клетках всех живых организмов и выполняют важнейшие функции по хранению, передаче и реализации наследственной информации. В состав нуклеиновых кислот входят азотистые основания двух типов: пуриновые - аденин (А), гуанин (G) и пиримидиновые - цитозин (С), тимин (Т) и урацил (U). Кольцо внизу- рибоза(в РНК, а у ДНК там дезоксирибоза). Верхнее правое: азотистое основание. Слева между двумя пентозами находится остаток фосфорной кислоты, скрепляющий нуклеозид(рибоза+азот. Основание) и следующую пентозу в цепи. Азотистые основания бывают(нарисуй в пустом месте под названием) Аденин Тимин Гуанин Цитозин Урацил

Биологическое значение нуклеиновых кислот. Одна из основных функций нуклеиновых кислот состоит в детерминации синтеза белков. Информация о структуре белков, закодированная в нуклеотидной последовательности ДНК, должна передаваться от одного поколения к другому, и поэтому необходимо ее безошибочное копирование, т.е. синтез точно такой же же молекулы ДНК (репликация). Репликация и транскрипция. С химической точки зрения синтез нуклеиновой кислоты - это полимеризация, т.е. последовательное присоединение строительных блоков. Такими блоками служат нуклеозидтрифосфаты.

• История изучения нуклеиновых кислот В 1847 из экстракта мышц быка было выделено^[1] вещество, которое получило название «инозиновая кислота». Это соединение стало первым изученным нуклеотидом. В течение последующих десятилетий были установлены детали его химического строения. В частности, было показано, что инозиновая кислота является рибозид-5'-фосфатом, и содержит N-гликозидную связь.

• В 1868 году швейцарским химиком Фридрихом Мишером при изучении некоторых биологических субстанций было открыто неизвестное ранее вещество. Вещество содержало фосфор и не разлагалось под действием протеолитических ферментов. Также оно обладало выраженными кислотными свойствами. Вещество было названо «нуклеином». Соединению была приписана брутто-формула C₂₉H₄₉N₉O₂₂P₃.

• Уилсон обратил внимание на практическую идентичность химического состава «нуклеина» и открытого незадолго до этого «хроматина» — главного компонента хромосом^[2]. Было выдвинуто предположение об особой роли «нуклеина» в передаче наследственной информации.

• В 1889 г Рихард Альтман ввел термин «нуклеиновая кислота», а также разработал удобный способ получения нуклеиновых кислот, не содержащих белковых примесей.

• Левин и Жакоб, изучая продукты щелочного гидролиза нуклеиновых кислот, выделили их основные составляющие — нуклеотиды и нуклеозиды, а также предложили адекватные структурные формулы, описывающие их свойства.

• В 1921 году Левин выдвинул гипотезу «тетрануклеотидной структуры ДНК»^[3], оказавшуюся впоследствии ошибочной^[4].

• В 1935 году Клейн и Танхаузер с помощью фермента фосфатазы провели мягкое фрагментирование ДНК, в результате чего были получены в кристаллическом состоянии четыре ДНК-образующих нуклеотида^[5]. Это открыло новые возможности для установления структуры этих соединений.

• В 1940-е годы научная группа в Кембридже под руководством Александера Тодда проводит широкие синтетические исследования в области химии нуклеотидов и нуклеозидов. В результате их работы были установлены все детали химического строения и стереохимии нуклеотидов. За цикл работ в этой области Александер Тодд был награждён Нобелевской премией в области химии в 1957 году.

• Чаргаффом было установлена закономерность содержания в нуклеиновых кислотах нуклеотидов разных типов, получившая впоследствии название Правило Чаргаффа.

• В 1953 году Уотсоном и Криком установлена вторичная структура ДНК, двойная спираль^[6].

23. Строение и уровни организации нуклеиновых кислот. Первичная структура нуклеиновых кислот. Видовые различия первичной структуры нуклеиновых кислот.

Схема связи цепей в ДНК

Структура нуклеиновых кислот, первичная структура.

Имеют несколько уровней структурной организации.

1. первичная структура. РНК и ДНК построены однотипно – представлены полинуклеотидной цепью, состоящей из отдельных мононуклеотодов, соединённых между собой 3’→5’-фосфодиэфирными связями. Эта связь образуется между фосфорным остатком одного мононуклеотида и 3’-ОН-группой пентозного остатка другого мононуклеотида. [рис. образования такой связи] Разные НК отличаются числом, порядком чередования и составом НК.

2. вторичная структура. По рентгеноструктурному анализу ДНК в 1953г Уотсон и Крик предложили модель строения ДНК, которая объясняла самовоспроизведение организмов, наследственную изменчивость. Вторичная структура представляет собой двойную спираль, состоящую из 2 полинуклеотидных цепей, закрученных вокруг одной общей оси. Эти цепи антипараллельны, т.е. одна идет в направлении 5’→3’, а другая 3’→5’. Пуриновому основанию одной цепи соответствует пиримидиновое основание другой цепи – эти основания комплиментарны друг другу, т.е. дополняют одно другое до целого. Между А и Т две водородные связи (А=Т), а между Г и Ц – 3 (ГЦ).

Молекула спирализована на всем протяжении, гидрофобные участки внутри спирали, их плоскости перпендикулярны основаниям и параллельны друг другу. В вертикальном направлении возникают гидрофобные взаимодействия. Вторичная структура стабилизируется водородными связями и гидрофобными взаимодействиями.

Вторичная структура РНК более простая, представляет собой одну полинуклеотидную цепь, в которой спирализованы лишь некоторые участки. Вторичная структура РНК представлена в виде клеверного листа. Для тРНК известна третичная структура в форме буквы Г. [рис. РНК в виде клеверного листа]

Видовые различия первичной структуры Существуют два типа нуклеиновых кислот – дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) и рибонуклеиновые кислоты (РНК). И те, и другие представляют собой полимерные молекулы, построенные из мономерных блоков – нуклеотидов: ДНК – из дезоксирибонуклеотидов, а РНК – из рибонуклеотидов.