Визначення фосфатази за реакцією з фенолфталеїнфосфатом натрію

Принцип методу. Фосфатаза інактивується при температурі пастеризації не нижче +63 °С з витримкою 30 хв. Метод ґрунтується на гідролізі фенолфталеїнфосфату натрію ферментом фосфатазою, який міститься в молоці і в молочних продуктах. Звільнений при гідролізі фенолфталеїн у лужному середовищі дає рожеве забарвлення.

Приготування аміачної буферної суміші: 80 мл 1н. розчину аміаку змішують з 20 мл 1н. розчину хлористого амонію (рН 9,8).

Приготування 0,1%-ного розчину фенолфталеїнфосфату натрію: 0,1 г порошкоподібного фенолфталеїнфосфату натрію розчиняють у мірній колбі на 100 мл невеликою кількістю буферної суміші і доводять до мітки буферною сумішшю.

Техніка проведення аналізу. В пробірки відміряють по 2 мл молока, 1 мл розчину фенолфталеїнфосфату натрію. Пробірки закривають корками і струшують вмістиме.

Пробірки поміщають у водяну баню з температурою воли в 40 до +45 °С, визначають забарвлення через 10 хв. і через годину.

Оцінка результатів. При відсутності ферменту фосфатази в молоці забарвлення вмісту пробірок не змінюється. Отже, молоко було піддане пастеризації при температурі не нижче +66 °С.

При наявності фосфатази в молоці і молочних продуктах вміст пробірок набуває забарвлення від світло-рожевого до яскраво-рожевого. Отже, молоко не піддавалось пастеризації, піддавалось при температурі нижче +63 °С, або було змішане з непастеризованим молоком. Чутливість методу дозволяє виявити додавання не менше 2 % непастеризованого молока в партії.

Результати досліджень:_______________________________________

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Висновки: _________________________________________________________________

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Визначення ліпази (якісна проба)

Техніка визначення.

1. У дві пробірки наливають по 10 крапель 5%-ного розчину сухого молока чи вершків.

2. У першу пробірку додають 5 крапель 5%-ного розчину панкреатину, в другу - 5 крапель води.

3. В обидві пробірки вносять по 1 краплі 1%-ного розчину фенолфталеїну і по краплях 1%-ний розчин Nа₂SO₃ до появи світло-рожевого забарвлення.

4. Пробірки поміщають у водяну баню чи термостат при температурі +38^оС на 30хв. після чого спостерігають за зміною забарвлення.

Техніка кількісного визначення. У 6 невеликих скляночок (ємністю 50 мл) чи широких пробірок наливають по 2 мл молока і по 10 крапель 5%-ного розчину панкреатину чи препарату ліпази. В першу склянку (контроль) приливають 1 краплю розчину фенолфталеїну і титрують 0,05н. розчином NаОН до рожевого кольору. Решту скляночок поміщають у водяну баню чи термостат. Кожні 10 хв. виймають по скляночці. Додають по 1 краплі розчину фенолфталеїну і відтитровують розчин лугом, як у першій скляночці, доводячи забарвлення до такої ж інтенсивності.

5. Кількість лугу, що пішла на титрування в кожній скляночці, після попереднього віднімання кількості лугу, що пішла на титрування контрольної проби, послідовно відкладають на осі ординат, а час витримки у водяній бані на осі абсцис.

Одержують криву зміни активності ферменту ліпази.

Активність ліпази можна визначити в мг% NаОН, що нейтралізує виділені в процесі гідролізу жирні кислоти:

Х = (0,05 х V х 100 х 0,97) / 2 = 2,425 х V

де 0,05 - нормальність розчину NаОН;

V - кількість розчину NаОН, що пішла на титрування 2 мл молока;

2 - кількість молока, взятого для аналізу, мл;

0,97 - коефіцієнт для перерахунку кількості молока з мл у грами.

Результати досліджень:_______________________________________

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Висновки: ________________________________________________________

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________