29. Дифференциально – диагностические среды: перечислить основные виды, принципиальный состав, назначение и использование в практике.

Для отличия одних видов бактерий от других на основании их ферментативной активности применяются дифференциально-диагностические среды. Например, среды Гисса, среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева, среда Олькеницкого. Среды Эндо, Левина, Плоскирева в чашках Петри применяются для дифференцировки бактерий кишечной группы по способности сбраживать лактозу. Эти среды содержат питательный агар, лактозу и индикатор, изменяющий свой цвет в кислой среде (индикатор рН). Если посеять на такую среду бактерии, которые сбраживают лактозу, например, кишечную палочку, то в результате сбражи­вания лактозы образуется кислота, и индикатор изменит свой цвет в кислой среде. Поэтому колонии кишечной палочки на таких сре­дах будут окрашены соответственно цвету индикатора: на среде Эндо и среде Плоскирева — в красный цвет, на среде Левина — в черно-синий. Если же на эти среды посеять бактерии, которые не сбраживают лактозу, например, палочки брюшного тифа или па­лочки дизентерии, то кислота не образуется, реакция среды ос­танется слабощелочной и цвет индикатора не изменится. Поэто­му колонии бактерий, не сбраживающих лактозу, на этих средах будут бесцветными. Среду Плоскирева можно отнести также и к элективным средам для выделения палочек дизентерии, так как эта среда содержит соли желчных кислот, задерживающих рост кишечной палочки, и краситель бриллиантовый зеленый, задер­живающий рост воздушной кокковой микрофлоры. Висмут-сульфит агар — это дифференциально-диагностическая среда, при­меняемая главным образом при диагностике сальмонеллезов. При росте сальмонелл происходит восстановление висмута из его солей и колонии сальмонелл окрашиваются в черный цвет. Диф­ференциально-диагностические среды Гисса («пестрого» ряда) готовятся на основе жидкой среды (пептонной воды) или полу­жидкого мясо-пептонного агара. Содержат какой либо углевод или многоатомный спирт (лактозу, глюкозу, маннит, сахарозу) и индикатор, который меняет свой цвет в кислой среде. В пробир­ку с жидкой средой Гисса помещен стеклянный поплавок. Если на среду Гисса посеять микроб, который сбраживает данный уг­левод с образованием кислоты и газа, то есть до конечных про­дуктов, то среда изменит свой цвет, в полужидкой среде появят­ся пузырьки и разрывы в толще агара, в жидкой среде — пузырек газа в поплавке. При сбраживании углевода только до промежу­точных продуктов (до кислоты) происходит только изменение цвета среды, Применяются также комбинированные среды, содержа­щие не один углевод, а два или три, например, среда Олькеницкого — трехсахарный агар с мочевиной. Одна пробирка среды Олькеницкого заменяет скошенный агар и среды Гисса с лакто­зой, сахарозой и глюкозой. Среда готовится на основе не очень плотного МПА. Содержит лактозу (1%), сахарозу (1%), глюкозу (0,1 %), мочевину, соль Мора (сульфат железа), гипосульфит на­трия и индикатор. Среду после стерилизации в расправленном виде наливают в пробирку так, чтобы получился столбик и ско­шенная часть. Посев производится штрихом по скошенной части и уколом в столбик. При сбраживании углеводов, которые содер­жатся в большем количестве (лактозы, сахарозы или обоих сахаров), изменяется цвет всей среды; при сбраживании только глю­козы изменяется цвет столбика, а скошенная часть остается без изменений. Образование газа определяется по наличию пузырь­ков в столбике агара. Культуры, расщепляющие мочевину с об­разованием аммиака, дают щелочную реакцию. При этом проис­ходит нейтрализация кислоты, образующейся при сбраживании углеводов, и цвет среды не изменяется. Расщепление мочевины свойственно протеям и некоторым кишечным палочкам. Патоген­ные энтеробактерии не разлагают мочевину. Добавление соли Мора и гипосульфита позволяет также изучить способность бак­терий к образованию сероводорода по почернению в столбике агара в результате превращения сульфата железа в сульфид чер­ного цвета.

Для экспресс-метода определения ферментативной актив­ности микроорганизмов применяются микротестсистемы и сис­тема индикаторных бумажек (СИБ). Микротестсистема представ­ляет собой контейнер из прозрачного полистирола, состоящий из нескольких ячеек. Ячейки содержат высушенные пит среды с углеводами и индикаторами рн. В каждую ячейку засе­вают взвесь культуры бактерий определенной густоты. В контроль­ные ячейки наливают физ. раствор. Результат учитывают после 3-4-часовой инкубации в термостате по изменению цвета инди­катора. Системы индикаторных бумажек (СИБ) для идентификации семейства энтеробактерии представляют собой диски или полоски хроматографической бумаги, покрытой защитной плен­кой из поливинилового спирта и содержащей определенный суб­страт и индикатор. В пробирке с физиологическим или буферным раствором вносят полную петлю исследуемой культуры или каплю густой микробной взвеси, затем обожженным пинцетом помещают в диски. В контрольные пробирки культуру бактерий не вносят. Результат учитывают по изменению цвета индикатора. Для определения сероводорода диск помещают в пробирку на поверхность МПА, засеянного уколом, что позволяет одновремен­но определить подвижность. Во всех пробирках учитывают пред­варительный результат в тот же день и окончательный — через восемнадцать — двадцать четыре часа. Оксидазная активность определяется путем растирания культуры на индикаторной бу­мажке через 30-60 секунд.

30. Выделение чистых культур аэробных и анаэробных бактерий. Перечислите принципы и методы получения изолированных колоний аэробов. Методы выделения чистых культур анаэробов. Описать по дням метод Вейнберга.

Культивирование и выделение чистых культур аэробных бактерий

Для культивирования микроорганизмов необходимы определенные условия: температура, аэробные или анаэробные условия.

Температура должна быть оптимальной для данного вида. Боль­шинство патогенных бактерий размножаются при 37°С. Однако для некоторых видов оптимальной является более низкая температура, что связано с особенностями их экологии. Так, для палочки чумы, ес­тественным местом обитания которой являются грызуны в период зимней спячки, оптимум температуры составляет 28°С, как и для лептоспир, для палочки ботулизма - 28°С-35°С.

Кроме оптимальной температуры, для культивирования микроор­ганизмов, в зависимости от вида, необходима аэробность или анаэробность среды.

Для того, чтобы изучить морфологию, Культуральные, биохими­ческие и другие свойства микробов, необходимо получить чистую куль­туру. Обычно культурой микробов называют скопление их на пи­тательной среде в виде помутнения, придонного (пристеночного) рос­та или пленки на поверхности жидкой среды или колоний на плотной среде. Отдельная колония образуется из одной микробной клетки. Чи­стая культура - это культура микробов одного вида, полученная из од­ной колонии. В лабораториях для различных исследований применя­ют определенные известные штаммы микробов. Штамм - это чистая культура микробов, полученная из определенного источника, в опре­деленное время, обладающая известными свойствами. Как правило, штаммы микробов обозначают определенным номером. Например, штамм Staphylococcus aureus 209P применяется для определения актив­ности пенициллина.

Выделение чистых культур аэробов занимает, как правило, три дня и производится по следующей схеме:

1-й день - микроскопия мазка из исследуемого материала, ок­рашенного (обычно по Граму) - для предварительного ознакомления с микрофлорой, что может быть полезным в выборе питательной среды для посева. Затем посев материала на поверхность застывшего пита­тельного агара для получения изолированных колоний. Рассев можно произвести по методу Дригальского на три чашки Петри с питательной средой. Каплю материала наносят на первую чашку и распределяют шпателем по всей чашке. Затем этим же шпателем распределяют остав­шуюся на нем культуру на второй чашке и таким же образом - на тре­тьей. Наибольшее количество колоний вырастет на первой чашке, наи­меньшее - на третьей. В зависимости от того, сколько было микробных клеток в исследуемом материале, на одной из чашек вырастут изоли­рованные колонии.

Такого же результата можно достигнуть, произведя рассев на од­ной чашке. Для этого делят чашку на четыре сектора. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами на первом секторе, затем, прокалив и остудив петлю, распределяют посев из пер­вого сектора во второй и таким же образом последовательно в тре­тий и четвертый сектор. Из отдельных микробных клеток после су­точного инкубирования в термостате образуются изолированные колонии.

2-й день - изучение колоний, выросших на чашках, описание их. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными или непроз­рачными, они имеют различные размеры, округлые правильные или неправильные очертания, выпуклую или плоскую форму, гладкую или шероховатую поверхность, ровные или волнистые, изрезанные края. Они могут быть бесцветными или иметь белый, золотистый, красный, желтый цвет. На основании изучения этих характеристик выросшие колонии разделяются на группы. Затем из исследуемой группы отби­рают изолированную колонию, готовят мазок для микроскопического исследования с целью проверки однородности микробов в колонии. Из этой же колонии производят посев в пробирку со скошенным пита­тельным агаром.

3-й день - проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре путем микроскопии мазка. При однородности исследуемых бак­терий выделение чистой культуры можно считать законченным.

Для идентификации выделенных бактерий изучаются культураль-ные признаки, то есть характер роста на жидких и плотных пита­тельных средах. Например, стрептококки на сахарном бульоне образуют придонный и пристеночный осадок, на кровяном агаре - мелкие, точечные колонии; холерный вибрион образует пленку на поверхности щелочной пептонной воды, а на щелочном агаре - прозрачные коло­нии; палочка чумы на питательном агаре образует колонии в виде «кру­жевных платочков» с плотным центром и тонкими волнистыми края­ми, а в жидкой питательной среде - пленку на поверхности, а затем -нити, отходящие от нее в виде «сталактитов».

Культивирование и выделение чистых культур анаэробных бактерий

Для культивирования анаэробов необходимо понизить окисли­тельно-восстановительный потенциал среды, создать анаэробиоз пу­тем удаления кислорода физическими, химическими или биологичес­кими методами.

К физическим методам можно отнести:

1) механическое удаление воздуха с помощью насоса из анаэ-ростата, в котором помещают чашки с посевами. Одновременно мож­но заменить воздух индифферентным газом: азотом, водородом, угле­кислым газом.

2) выращивание в среде, содержащей редуцирующие вещества. Сре­да Китта-Тароцци - это сахарный бульон с кусочками печени или мяса. Глюкоза и кусочки органов обладают редуцирующей способностью. Среду заливают сверху слоем вазелинового масла, чтобы преградить доступ кислорода воздуха.

3) Наиболее простой, но менее надежный способ - выращивание в глубине высокого столбика сахарного агара.

Химические методы заключаются в том, что чашки с посевами ана­эробов ставят в герметически закрытый эксикатор, куда помещают хи­мические вещества, например, пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода.

Биологический метод основан на одновременном выращивании анаэробов и аэробов на плотных питательных средах в чашках Пет­ри, герметически закрытых после посева. Вначале кислород погло­щается растущими аэробами, а затем начинается рост анаэробов.

Выделение чистой культуры анаэробов начинают с накопления анаэробных бактерий путем посева на среду Китта-Тароцци. В даль­нейшем получают изолированные колонии одним из двух способов:

1) посев материала производят путем смешивания с расплавленным теплым сахарным агаром в стеклянных трубках. После застывания ага­ра в глубине его вырастают изолированные колонии, которые извле­кают путем распила трубки и пересевают на среду Китта-Тароцци (спо­соб Вейнберга);

2) посев материала производят на чашки с питательной средой и инкубируют в анаэростате. Выросшие на чашке изолированные ко­лонии пересевают на среду Китта-Тароцци (способ Цейсслера).