ДНК-МАРКЕРЫ В ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ: ТИПЫ МАРКЕРОВ, ИХ СВОЙСТВА И ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ
В обзоре рассмотрены разные типы ДНК-маркеров, их достоинства и недостатки, области применения. Показано, что использование в качестве маркерных систем полиморфных последовательностей ДНК, созданных на основе ПЦР, позволило решить проблему насыщения геномов маркерами и маркировать практически любые участки ДНК. Развитие высоко технологичных методов анализа полиморфизма ДНК привело к созданию нового типа маркеров (SNPs), объединяющего значительную часть ДНК-маркеров, ранее рассматривающихся как самостоятельные группы (ПЦР-ПДРФ, SSCP и др.). Рассматривается популярность различных типов молекулярных маркеров в различные периоды времени (с 1966 по 2003 г.г.) и предлагается прогноз на будущее. Предполагается, что в наше время происходит смена методологии научных исследований и переход к массовому скринингу образцов с использованием высоких технологий. Успехи в развитии генетических исследований обусловлены наличием информативных генетических маркеров. Первоначально в качестве генетических маркеров использовались морфологические (фенотипические) признаки, например, с использованием маркеров этого типа в 1913 г. была построена первая генетическая карта (карта генома Drosophilla melanogaster). Однако количество информативных маркеров этого типа ограничено. Кроме того, морфологические признаки могут иметь сложный характер наследования и часто зависят от условий внешней среды [56]. Развитие молекулярных методов исследований позволило создать новые тест-системы, позволившие анализировать генетический полиморфизм на уровне продуктов генов (белковый или биохимический полиморфизм) и на уровне генетического материала клетки (полиморфизм ДНК). Биохимические маркеры Первыми молекулярными маркерами были маркеры, созданные на основе анализа белкового полиморфизма (биохимические маркеры) Использование нескольких сотен биохимических маркеров позволило оценить уровень генетического полиморфизма у более 2000 биологических видов (от микроорганизмов до человека) и разработать основные теоретические положения популяционной генетики [1, 43, 44, 60]. Однако в ходе исследований выяснились и ограничения в применении этого типа маркеров. Прежде всего, это то, что анализ белков позволяет исследовать полиморфизм только белок-кодирующих последовательностей и только у экспрессирующихся генов. Если учесть, что у высших эукариот всего около 1% генома составляют белок-кодирующие последовательности, очевидно, что от внимания исследователей ускользает основная часть генома. При этом из анализа исключаются такие функционально-значимые участки, как промоторные области, энхансеры, различные сайты регуляции, расположенные в интронах, нетранслируемых областях генов, а также вне генов, часто на значительном расстоянии от кодирующей последовательности. Возможности указанного метода ограничиваются также низким уровнем белкового полиморфизма в популяциях домашних животных, птиц, культурных растений [19, 41, 91], ограничениями в выборе биологического материала и времени его сбора. Более перспективным представляется использование в качестве маркерных систем полиморфных нуклеотидных последовательностей ДНК, позволяющих тестировать генетический полиморфизм непосредственно на уровне генов, а не на уровне продуктов генов, как в случае использования метода белкового полиморфизма. ДНК-маркеры позволяют решить проблему насыщения генома маркерами и маркировать практически любые участки ДНК, в том числе некодирующие. Кроме того, эта маркерная система дает возможность использовать для анализа любые ткани и органы, независимо от стадии развития организма и имеет целый ряд преимуществ по сравнению с другими типами маркеров (табл. 1).
ДНК-маркеры, основанные на анализе рестрикционного полиморфизма Открытие и выделение рестрицирующих эндонуклеаз (рестриктаз) [16], расщепляющих ДНК в участках со строго определенной последовательностью, позволило разработать маркеры на основе анализа рестрикционного полиморфизма ДНК. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ, англ. RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism). Впервые ПДРФ был использован как генетический маркер в 1974 г. при идентификации термо-чувствительной мутации в геноме аденовируса [37]. Однако широкое применение вариантов полиморфизма ДНК в качестве генетических маркеров началось с 1980 г. после выхода основополагающей работы Ботштейна с соавт. [22], в которой были изучены свойства ПДРФ как генетического маркера, дано теоретическое обоснование его использования и предложен метод оценки уровня информативности (PIC - polymorphism information content). Самими авторами метод был с успехом применен для картирования генома человека [22]. ПДРФ используют для анализа полиморфизма конкретных локусов (генов). Способ анализа ПДРФ сводится к обработке ДНК рестриктазами с последующим электрофоретическим разделением полученной смеси и определением длин рестрикционных фрагментов после блот-гибридизации со специфическим меченым зондом. Так как рестрицирующие эндонуклеазы имеют строго специфические места расщепления, то генетические различия в нуклеотидной последовательности ДНК между индивидуумами (т.е. полиморфизм на уровне ДНК) приведут к различному распределению сайтов рестрикции вдоль соответствующих молекул ДНК и получению продуктов рестрикции, в которых длина гомологичных фрагментов будет различаться. Таким образом, полиморфизм ДНК будет тестироваться как ПДРФ. Подробнее с методологией ПДРФ можно ознакомиться в многочисленных обзорах [2, 10, 20, 21 и др.]. Основной причиной, приводящей к возникновению полиморфизма ДНК, первоначально считались точковые мутации (а также микроделеции и инсерции), затрагивающие сайты узнавания тех или иных эндонуклеаз рестрикции [22]. В последующих работах спектр возможных причин был расширен, и в настоящее время основная роль отводится таким факторам, как крупные делеции и вставки [89], трансверсии, транслокации, транспозиции мобильных генетических элементов [77] и т.п. Кроме того, некоторые рестриктазы не способны расщеплять ДНК, если сайт узнавания содержит один или несколько метилированных цитозиновых остатков. Такие ферменты также могут выявить полиморфизм, если имеются вариации в характере метилирования (цит. по [9]). С использованием ПДРФ-маркеров были получены первые успешные результаты по построению молекулярно-генетических карт многих видов растений и животных, накоплены обширные сведения о генетическом полиморфизме различных организмов, выявлены ассоциации с хозяйственно-полезными признаками [20, 21, 26, 76, 78, 81]. Важным достоинством данного типа маркеров является высокая воспроизводимость результатов, а также кодоминантный тип наследования. ПДРФ-локусы могут обладать множественными аллелями, что повышает их информативность. ПДРФ-анализ митохондриальной ДНК и кластера генов, кодирующих рибосомные РНК (рДНК), широко используется в популяционной генетике, биогеографических и филогенетических исследованиях [18]. Высокий консерватизм ПДРФ-маркеров позволяет использовать их при сравнительном картировании родственных видов. Например, появление детальных генетических карт многих растений позволило сравнить между собой ряд геномов, благодаря использованию общего набора ПДРФ-зондов [63]. ДНК-фингерпринт (синоним - "геномная дактилоскопия") позволяет исследовать полиморфизм множества локусов повторяющихся последовательностей (мультилокусный анализ). Анализ проводится тем же способом, что и в случае ПДРФ, но в качестве специфического гибридизационного зонда используются последовательности повторяющихся последовательностей - минисателлитов. Минисателлиты диспергированы по геному и представляют собой последовательности, состоящие из многократно повторенной единицы ("мотива" или "коровой" последовательности) длиной от 9 до 100 и более п.н. (тандемно повторяющиеся последовательности). Отдельные последовательности отличаются друг от друга по общей длине (числу повторов "мотива"), а также по некоторым вариациям в нуклеотидной последовательности "мотива". Использование "коровых" последовательностей в качестве зондов при гибридизации позволяет выявлять множество участков рестрикционного полиморфизма и получать высокоспецифическую картину гибридизации геномной ДНК, характерную для конкретного индивида (особи). Показано, что с помощью данного подхода в геноме млекопитающих можно выявить более 30 высокополиморфных локусов, что достаточно для индивидуальной идентификации человека, растений, животных) [6, 48, 87]. Многие "коровые" минисателлитные последовательности высоко консервативны и могут быть использованы для выявления аналогичных последовательностей в ДНК самых разных организмов [6, 47, 87]. Описаны минисателлитные зонды не только универсального характера, но и локус-специфичные [42]. Локус-специфичные минисателлиты можно получить также клонированием экстрагированных из геля фрагментов, дающих отдельную полосу на фингерпринте ДНК [96]. Монолокусные минисателлиты высокоинформативны и могут быть эффективно использованы для анализа групп сцепления генов. Основными механизмами возникновения и поддержания полиморфизма в минисателлитах считаются неравный кроссинговер и генная конверсия. При этом высокую вариабельность (нестабильность) минисателлитов связывают не с внутренним свойством повторяющейся последовательности, а с инициатором мутаций, фланкирующим повтор [24], и активацией мутагенных систем генома [48]. Скорость мутационного процесса в гипервариабельных минисателлитных локусах человека выше, чем в целом для геномной ДНК, и составляет в среднем на гамету 10-4 на 1 т.п.н. минисателлита [48]. В силу чрезвычайно высокого полиморфизма этот тип маркеров не применяется в популяционных или филогенетических исследованиях, а используется для индивидуальной идентификации человека, растений и животных. К недостаткам методов рестрикционного анализа с использованием блот-гибридизации (ПДРФ, минисателлиты), ограничивающим их распространение, следует отнести применение радиоактивных изотопов, длительность и трудоемкость процедуры, необходимость использования для анализа больших количеств ДНК высокого качества. ДНК-маркеры, основанные на полимеразной цепной реакции Мощным толчком для создания новых типов ДНК-маркеров стало изобретение Кэри Мюллисом в 1983 г. метода амплификации in vitro определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов полимеразной реакции (ПЦР - полимеразная цепная реакция, англ. PCR - Polymerase Chain Reaction). В 1985 году этот метод был впервые применен на практике для амплификации участка гена бета-глобина с помощью Большого фрагмента ДНК-полимеразы (фрагмента Кленова) [72]. Широкое распространение ПЦР началось с момента публикации в 1988 г. основополагающей работы Сайки с соавт. [71], в которой авторы использовали термофильные ДНК-полимеразы и рассмотрели теоретические основы метода. Эта статья в 1988-89 г.г. стала наиболее цитируемой, а в 1993 году Кэри Мюллису была присвоена нобелевская премия за изобретение метода ПЦР. Метод ПЦР позволяет быстро и с небольшими затратами материальных ресурсов и времени получить более 10 миллионов копий определенной последовательности ДНК, первоначально представленной одной или несколькими молекулами. Различные модификации метода ПЦР легли в основу создания разнообразных типов ДНК-маркеров, широко используемых в настоящее время в различных областях биологии и медицины. Классификация ДНК-маркеров до сих пор не сформирована, что объясняется не только их многообразием, но и тем, что при введении тех или иных модификаций в известный метод, авторы часто дают новое наименование получаемым ими маркерам. Предложено объединить ДНК-маркеры, созданные на основе ПЦР, в два основных класса: маркеры, созданные на основе небольших изменений в нуклеотидной последовательности ДНК уникальных локусов, и маркеры на основе изменения числа повторов в тандемно повторяющихся последовательностях ДНК [75]. Очевидно, что такая классификация недостаточна, поскольку перечисленные классы гетерогенны и включают в себя ДНК-маркеры, резко различающиеся по своим свойствам. Кроме того, сюда не включены маркеры, которые использовались как мономорфные маркеры при построении физических карт хромосом человека и других организмов. В данном обзоре предпринята попытка более детальной классификации и характеристики ДНК-маркеров, созданных на основе ПЦР. Мономорфные ДНК-маркеры STSs-маркеры (от англ. sequence tagged sites). Первая попытка систематизации ДНК-маркеров была предложена в 1989 году Ольсоном с соавторами [65]. Им была сформулирована идея создания системы STS-маркеров, которая была призвана стандартизовать все обозначения маркированных последовательностей ДНК в геноме и включить в себя все типы картированных последовательностей. Первоначально STS-маркеры создавались на основе различных технологий, но впоследствии был осуществлен перевод практически всех STSs на основу ПЦР для более удобного использования. Основные требования к STSs - знание их нуклеотидной последовательности и уникальность в геноме. STSs можно рассматривать как мономорфные ДНК-маркеры, поскольку их используют в экспериментах, где наличие полиморфизма не требуется, в таких, например, как построение физических карт геномов или выявление тестируемых последовательностей в рекомбинантных клонах или генетически модифицированных организмах. "Перевод" всех обозначений на язык STS позволил анализировать данные по маркерам через базы данных и оптимизировать процесс "насыщения" маркерами физических карт геномов человека и животных. Создание единой базы данных для STS-маркеров способствовало лучшему взаимодействию разных лабораторий и увенчалось, в конечном итоге, построением тонких физических карт хромосом и секвенированием геномов человека и ряда других объектов [см. компьютерные базы данных: NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), Genethon (carbon.wi.mit.edu:8000/cgi-bin/contig/phys_map), CEPH-Genethon (www.cephb.fr/bio/ceph-genethon-map.html), GDB (Genome Data Base) (http://www.gdb.org/), и др.]. EST-маркеры (от англ. "Expressed Sequence Tags") являются одной из разновидностей STSs и представляют собой маркеры к экспрессирующимся последовательностям генома (генам). Основным источником информации для создания EST-маркеров является использование нуклеотидных последовательностей комплементарных ДНК, получаемых с помощью обратной транскриптазы на основе мРНК, изолированных из разных тканей и представляющих экспрессирующиеся в этих тканях гены (кДНК). ESTs используются для построения транскрипционных карт геномов, выявления тестируемых генов, поиска новых генов [см.базу данных: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/]. NotI-STS-маркеры содержат последовательности, примыкающие к сайтам узнавания рестриктазы NotI (5'GCGGCCGC3'). Эти маркеры удобны для построения макрорестрикционных карт человека и животных, поскольку NotI-сайты относительно равномерно распределены в их хромосомах и локализованы в ГЦ-обогащенных последовательностях (CpG-островках), которые, как известно, присутствуют в 5'-областях генов, являются сайтами метилирования и участвуют в регуляции экспрессии генов [7, 15]. Было показано, что более 90% NotI-STSs имеют полную или частичную гомологию с известными генами человека и других организмов [79]. Таким образом, NotI-STSs маркируют гены человека и являются удобными маркерами как для локализации и выделения известных генов, так и для поиска новых ранее не описанных генов. По своей информативности NotI-STSs, как маркеры генов, не уступают ESTs. Высокий консерватизм NotI-STSs позволяет использовать маркеры, созданные на основе нуклеотидной последовательности генома человека, для картирования геномов и поиска генов у других объектов [98]. ДНК-маркеры на основе ПЦР с праймерами, имеющими множественную локализацию в геноме Особый класс ДНК-маркеров основан на использовании праймеров, имеющих множественную локализацию в геноме. Это может быть достигнуто при использовании одного короткого праймера с произвольной последовательностью (RAPD - Randomly amplified polymorphic DNA и ее аналогов), при использовании праймеров с искусственно добавленными последовательностями (адаптерами) (AFLP - Amplified fragment length polymorphism) или праймеров, комплементарных к повторяющимся элементам генома, таким как микросателлиты (ISSR - Inter-simple-sequence-repeats) или транспозоны (IRAP- Inter-retransposon amplified polymorphism). RAPD-маркеры. К этой группе относятся маркеры, основанные на ПЦР с применением праймеров с произвольной, случайной последовательностью. Для синтеза таких праймеров нет необходимости в знании конкретных нуклеотидных последовательностей генома исследуемого организма. Праймеры с произвольной последовательностью должны лишь отвечать определённым требованиям по соотношению GC-пар (около 60%) и длине. Этот метод был предложен независимо двумя группами исследователей и получил название RAPD (Random Amplified Polymophic DNA) или AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR) [94, 95]. Суть метода заключается в амплификации фрагментов ДНК с использованием единичного короткого праймера с низкой температурой отжига в реакции ПЦР. Праймер связывается с геномной ДНК в двух различных участках инвертированных повторов. При электрофоретическом разделении амплифицированных продуктов образуются дискретные продукты, размер которых варьирует от 100 до 5000 п.н. (ДНК-паттерны). Эти фрагменты представляют собой анонимную, как правило, уникальную последовательность ДНК, заключенную между двумя инвертированными повторами. Различия в ДНК-паттернах определяются различиями в одном или обоих праймер-связывающих сайтах (наличие или отсутствие полосы ПЦР-продукта в спектре) или присутствием инсерции/делеции в амплифицируемом фрагменте (различия ПЦР-продуктов по размеру). Большинство RAPD-маркеров являются доминантными (наличие/отсутствие полосы в ДНК-паттерне) [95]. Несколько позже были предложены другие сходные технологии: DAF (DNA Amplified Fingerprinting) [27] и УП ПЦР (ПЦР с универсальными праймерами) [3, 4]. Все описанные методики различаются размерами праймеров (10-12 нуклеотидов в случае RAPD, около 20 нуклеотидов в случае AP-PCR, 7-8 нуклеотидов в случае DAF и 25-27 нуклеотидов в случае УП-ПЦР), их составом (от 50 до 80% ГЦ-пар), температурой отжига и методами выявления продуктов реакции (окрашивание бромистым этидием, радиоавтография, серебрение). RAPD-анализ может служить своеобразным экспресс-методом выявления генетического полиморфизма, что особенно актуально для малоизученных таксономических групп. Диагностические возможности RAPD-технологии успешно проиллюстрированы на многочисленных примерах описания генетического разнообразия микроорганизмов, высших растений, беспозвоночных и позвоночных животных [27, 92, 94, 95]. RAPD применяется также для геномного маркирования в популяционных и эволюционных исследованиях. Например, для разных видов грибов с помощью УП-ПЦР показана видоспецифичность ДНК-паттернов [3, 4]. Наиболее подробно с помощью RAPD-PCR изучались культурные растения, cельскохозяйственные и лабораторные животные с целью идентификации и дифференциации пород и отдельных линий, картирования хромосом и маркирования хозяйственно-ценных признаков [5, 8, 59]. Показаны ассоциации некоторых RAPD-маркеров с генами резистентности к различным болезням у растений [59]. К недостаткам метода следует отнести низкую воспроизводимость результатов, обусловленную повышенной чувствительностью к условиям реакции: концентрации ионов магния, соотношению праймер/матрица, температурному режиму. Тем не менее RAPD-анализ может быть использован как экспресс-метод выявления генетического полиморфизма и как источник уникальных локус-специфичных маркеров. Для получения локус-специфичных маркеров интересующий исследователя фрагмент экстрагируют из геля, клонируют и секвенируют. На основе полученного сиквенса подбирают праймеры, которые амплифицируют единичный фрагмент с высокой степенью воспроизводимости. Полученные таким способом вторичные маркеры названы SCAR-маркерами (Sequence Characterized Amplified Region) [67]. Многие из них кодоминантны и могут быть использованы как уникальные маркеры в различных областях исследований. Полиморфизм SCAR-маркеров может быть увеличен путем рестрикционного анализа ПЦР-продукта. Полиморфизм длин продуктов амплификации (AFLP-маркеры) Для исследования вариабельности генома в целом может быть также использован метод анализа AFLP. Этот метод также не требует ни предварительного клонирования, ни секвенирования ДНК. Особености этого подхода заключаются в использовании в качестве матрицы рестрицированных фрагментов ДНК, лигированных со специфическими олигонуклеотидными адаптерами, и проведении избирательной амплификации со специально сконструированными праймерами. Праймеры состоят из фиксированной части, содержащей последовательность, комплементарную адаптеру и сайту рестрикции использованной эндонуклеазы (~ 15 нуклеотидов), и короткого фрагмента (на 3'-конце) с произвольной последовательностью нуклеотидов (2-4 нуклеотида) [57, 88]. Фиксированная часть придает праймеру стабильность и, в результате, хорошую воспроизводимость метода, а короткая последовательность со случайным набором нуклеотидов позволяет определять и контролировать пропорцию лигированных фрагментов, которые могут быть амплифицированы. С каждой парой праймеров амплифицируется 75-100 фрагментов (AFLP-финргерпринтинг), которые разделяют в агарозном или полиакриламидном геле. Поскольку каждый фрагмент представляет собой уникальный сайт, количество локусов, анализируемых одновременно с каждой комбинацией праймеров, гораздо больше, чем при любой другой технике анализа полиморфизма ДНК. С одного геля обычно удается получить до 40 полиморфных локусов. Этот тип полиморфизма ДНК также имеет доминантный тип наследования. AFLP-маркеры часто наследуются как тесно сцепленные кластеры в районе центромеры или теломеры хромосом, но наблюдается и случайное распределение маркеров вне этих кластеров, что позволяет, используя этот подход, быстро генерировать сотни высоковоспроизводимых маркеров [68]. AFLP-маркеры были успешно использованы для геномного картирования [55, 85], в популяционных и филогенетических исследованиях [25]. В последние годы эти маркеры получают все более широкое распространение для исследования мало изученных таксономических групп. ISSR. Для создания ISSR-маркеров используют праймеры, комплементарные микросателлитным повторам (4-12 единицам повтора) и несущие на одном из концов последовательность из двух-четырех произвольных нуклеотидов (так называемый "якорь"). Такие праймеры позволяют амплифицировать фрагменты ДНК, которые находятся между двумя достаточно близко расположенными микросателлитными последовательностями (как правило, это уникальная ДНК). В результате амплифицируется большое число фрагментов, представленных на электрофореграмме дискретными полосами (ISSR-фингерпринтинг). Полученные паттерны ПЦР-продуктов видоспецифичны [38, 101]. ISSR-маркеры также относятся к маркерам доминантного типа наследования, полиморфизм которых тестируется по наличию/отсутствию полосы. Аналогично RAPD и AFLP для создания ISSR-маркеров не требуется предварительного знания нуклеотидной последовательности исследуемой ДНК. Метод обладает хорошей воспроизводимостью и наряду с AFLP может быть с успехом использован для выявления межвидовой и внутривидовой генетической изменчивости, идентификации видов, популяций, линий, а в ряде случаев и для индивидуального генотипирования [38, 61, 101]. ISSR-маркеры могут быть использованы также для картирования геномов и маркирования хозяйственно-полезных признаков [33, 45]. Микросателлиты Микросателлиты - первые, полученные с использованием ПЦР, высокополиморфные маркеры для индивидуальных локусов. Подобно минисателлитам, микросателлиты относятся к диспергированным тандемно повторяющимся последовательностям, но единицы повторов (ди-, три- и тетрануклеотиды) и общий размер повторяющейся области существенно короче (как правило, не более 100 п.н.). Эти маркеры известны под несколькими названиями: микросателлиты, STMS (Sequence Tagged Microsattelite Site), STR (short tandem repeat), SSR (simple sequence repeat) [54, 82, 93]. По аналогии с системой STS была предложена система STMS, которая фактически является частью системы STS. Для создания STR подбираются праймеры к уникальным последовательностям ДНК, фланкирующим микросателлитный повтор, что требует предварительного знания их нуклеотидной последовательности. Полиморфизм STR определяется различной копийностью мономерных единиц в кластере, что приводит к существованию множественных аллельных вариантов. Гетерозиготность их очень высока (часто более 75%). При создании новых полиморфных маркеров, кроме динуклеотидов, используются микросателлиты три- и тетрамерных мотивов, значительная часть которых также высокогетерозиготна. Благодаря большей длине звена, применение тримеров и тетрамеров позволяет упростить методику анализа аллельного полиморфизма. Микросателлиты широко распространены в эукариотических геномах (как растительных, так и животных). Например, в геноме человека динуклеотидные повторы встречаются в среднем каждые 2 т.п.н. Согласно общепринятой точке зрения, полиморфизм микросателлитов обусловлен ошибками (эффект "проскальзывания") в процессе репликации или репарации ДНК [83]. Средний темп мутирования динуклеотидных повторов оценивают примерно в 6,9х10-4 [99], хотя эти оценки могут существенно различаться [49]. Высокий уровень полиморфизма микросателлитов, относительно равномерное их распределение в эухроматиновой части геномов и широкая представленность сделали их чрезвычайно популярными. Применение их при картировании генома человека позволило совместить физические и генетические карты хромосом. Гипервариабельные микросателлиты представляют собой универсальную систему генетических маркеров для анализа наследуемых изменений на уровне ядерной ДНК и широко используются в исследованиях генетического полиморфизма популяций человека, растений и животных. Несмотря на высокую популярность микросателлитов, они имеют и некоторые недостатки. Неравномерность скорости мутирования разных микросателлитов создает определенные сложности для популяционно-генетического анализа. Имеются и технические проблемы, такие как артефакты при проведении ПЦР (за счет эффекта "проскальзывания"), сложности в разработке технологий для автоматического скрининга микросателлитных аллелей. Кроме того, несмотря на высокую плотность микросателлитных локусов в геноме, их бывает недостаточно для тонкого картирования отдельных областей геномов, создания маркеров для локусов количественных признаков (QTL) и решения многих других задач. Полиморфные маркеры, основанные на тестировании однонуклеотидных замен (SNPs) Согласно общепринятому определению SNPs (от англ. Single Nucleotide Polymorphism) - это однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых в популяции имеются различные варианты последовательностей (аллели) с частотой редкого аллеля не менее 1% [23]. В базы данных SNPs обычно включают все небольшие изменения геномных последовательностей (небольшие инсерции/делеции (так называемые "intels"), изменения нескольких нуклеотидов), хотя они и не входят в формальное определение SNPs. Обычно SNPs представлены двумя аллельными вариантами, хотя встречаются и трехаллельные SNPs (например, в геноме человека их около 0,1% от всех SNPs) [52]. SNPs не являются совершенно новым типом ДНК-маркеров. Самые первые ДНК-маркеры (ПДРФ-маркеры) также относятся к этому типу. Однако введение этого термина позволило объединить под общим названием все маркеры, обусловленные одиночными нуклеотидными заменами в последовательности ДНК, независимо от способа их тестирования. SNPs чрезвычайно широко распространены не только в геноме человека, но и в геномах других организмов. Предполагается, что у человека точковые замены наблюдаются один раз на 1000 нуклеотидов. В настоящее время в базах данных по нуклеотидным последовательностям человека представлены около 6 млн. SNPs. Огромное количество SNPs в геноме человека позволяет отобрать порядка 100000 так называемых "распространенных" (с частотой редкого аллеля более 20%) SNP-маркеров, при среднем расстоянии между маркерами 30 т.п.н. [52]. Никакой другой тип геномных различий не способен обеспечить такую плотность маркеров. Помимо высокой плотности, SNPs имеют низкий уровень мутаций на поколение (~10-8), что делает их удобными маркерами молекулярной эволюции при оценке крупномасштабных эволюционных событий [32, 53]. Основным достоинством SNPs является возможность использования автоматических методов их детекции, например, использование ДНК-микропанелей (microarrays) [29]. Существующие способы тестирования SNPs можно условно разделить на несколько групп, представленных в табл.2. Разделение условно, поскольку в большинстве случаев используются сочетания различных подходов. Подробно с методами типирования SNPs можно ознакомиться в обзоре, представленном на сайте http://www.molbiol.ru. Здесь мы рассмотрим лишь некоторые, наиболее распространенные методы. Наиболее простой и надежный способ идентификации SNPs у хорошо изученных объектов - компьютерный анализ ESTs, представленных в базах данных. ПЦР-ПДРФ. Этот метод относится к ферментативным методам анализа SNPs и аналогичен методу ПДРФ, но в его основе лежит использование ПЦР. Рестрикции (одной или несколькими рестриктазами) в этом случае подвергаются продукты амплификации, а не геномная ДНК. Благодаря простоте и надежности метод получил широкое распространение и до сих пор используется для анализа аллельного полиморфизма генов у самых разных объектов [11-14, 18, 84, 86]. Ограничением метода является то, что с его помощью можно тестировать только известные мутации, затрагивающие сайты рестрикции. В зарубежных публикациях широко используется термин CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) - рестрикционный полиморфизм амплифицированных последовательностей. CAPS-маркеры считаются вторичными маркерами, так как праймеры для них создаются после выявления SNP на основе анализа нуклеотидной последовательности [84]. Аллель-специфичная ПЦР. Аллельные варианты различаются за счет того, что 3'-концевой нуклеотид одного из праймеров гибридизуется непосредственно с вариабельным нуклеотидом (позиция SNP), что обуславливает наличие или отсутствие ПЦР [51]. Специфичность реакции можно повысить, вводя дополнительный, не спаренный нуклеотид во второй или третьей позиции с 3'-конца этого же праймера или используя конкурирующую ПЦР в той же пробирке [74, 100]. Аллель-специфичная ПЦР широко используется для типирования отдельных аллелей генов, или групп аллелей, несущих одинаковые мотивы, например, для типирования аллелей, определяющих устойчивость или восприимчивость крупного рогатого скота к лейкозу [13, 14, 97]. ПЦР с терминацией синтеза. Существует несколько вариантов этого подхода. В одном из них ПЦР проводится по стандартной схеме, но один из дезоксинуклеозидтрифосфатов берется в лимитирующей реакцию концентрации [28]. Это приводит к тому, что после нескольких циклов синтез ДНК обрывается в позициях, соответствующих лимитирующему нуклеотиду. Реакция напоминает секвенирование. Метод прост в исполнении, но для детекции SNP не очень удобен, т.к. требует подбора условий ПЦР для каждого локуса. Однонитевой конформационный полиморфизм ДНК (SSCP, Single Strand Conformation Polymorphism) в особенности эффективен для поиска новых однонуклеотидных замен в ДНК. Метод SSCP заключается в следующем: после проведения PCR продукт амплификации денатурируют и полученные однонитевые молекулы разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле [66]. Любая нуклеотидная замена в исследуемой последовательности приводит к изменению заряда однонитевого фрагмента, а следовательно, и его электрофоретической подвижности и может быть тестирована в качестве полиморфного варианта. Этот подход позволяет выявлять нуклеотидные замены, делеции, инсерции на протяжении всей длины амплифицированного продукта, а не только в местах узнавания рестриктаз, что делает этот подход более информативным. Простота метода, умеренная стоимость и возможность использования флуоресцентной метки и капиллярного электрофореза (ABI Prism 310) позволяет легко автоматизировать процесс и анализировать одновременно большое количество локусов. Для типирования однонуклеотидных замен в ПЦР-продуктах могут быть использованы методы электрофореза в денатурирующих гелях с постоянной концентрацией денатурирующего агента (CGGE - constant gradient gel electrophoresis), с градиентом денатурирующего агента (денатурирующий градиентный гель-электрофорез, DGGE - denaturating gradient gel electrophoresis) [34, 58], или с использованием градиента температуры (TGGE - temperature gradient gel electrophoresis) [70]. Методы разделения основаны на различиях в температуре плавления фрагментов ДНК с разной нуклеотидной последовательностью. Содержащий мутацию фрагмент обнаруживается по изменённой электрофоретической подвижности. В качестве денатурирующих агентов используют чаще всего формамид или мочевину. Анализ гетеродуплексов. В этом случае денатурированные контрольный и анализируемый ПЦР-продукты не разделяют в геле, а сначала позволяют им ренатурировать. Одноцепочечные фрагменты образуют гомодуплексы, если последовательности двух цепей полностью комплементарны, или гетеродуплексы, если они отличаются хотя бы на один нуклеотид. Гомо- и гетеродуплексы имеют разную электрофоретическую подвижность, что используется для их разделения [17]. Для тестирования гетеродуплексов могут быть использованы химические методы их расщепления [30], обеспечивающие практически 100%-ное узнавание всех типов гетеродуплексов, что недоступно при использовании современных ферментативных подходов. К недостаткам метода следует отнести сложность процедуры и токсичность используемых реагентов. Детекция на твёрдых подложках (микропанелях, англ. microarrays). Микропанель - это твердый носитель небольшого размера (например, стекло, нейлон или металлическая пластинка) с прикрепленными к нему в определенном порядке короткими олигонуклеотидами или фрагментами ДНК. Прикрепление одного из компонентов реакции к подложке позволяет проводить параллельно множество реакций, пространственно разделив детекцию отдельных SNPs. Микропанели могут применяться как для скрининга мутаций, так и для детекции известных аллелей [40, 90]. О наличии/отсутствии мутации судят по уровню гибридизационного сигнала тестируемой ДНК с иммобилизованными на матрице фрагментами. В случае поиска еще неизвестных SNP на матрице иммобилизуются олигонуклеотиды, содержащие в каждой позиции любой из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов [73] (VDA, variant detector array). Олигонуклеотид, полностью комплементарный флуресцентно-меченому зонду, даст более сильный сигнал, чем отличающиеся от него в одной из позиций [90]. Скринирование уже известных SNPs значительно упрощается, так как в каждом случае нужны только те олигонуклеотиды, которые соответствуют известным аллельным вариантам. Такие аллель-специфичные наборы олигонуклеотидов были использованы для генотипирования SNPs в различных генах человека [31]. Дальнейшее усовершенствование метода идет в сторону увеличения количества и плотности расположения олигонуклеотидов на носителе, а также повышения чувствительности и специфичности гибридизации [39, 64]. Анализируемая ДНК может использоваться в качестве матрицы для синтеза продукта с иммобилизованного олигонуклеотида (метод минисеквенирования). Существует множество вариаций этой методики. Например, использование вместо дезокситрифосфатов меченых дидезокситрифосфатов позволяет получить информацию о следующем за праймером нуклеотиде, соответствующем позиции SNP [62]. Физические методы детекции SNP. Альтернативой существующим методам детекции полиморфных участков ДНК является масс-спектрометрическое дифференциальное секвенирование. Время, затрачиваемое на анализ каждого образца этим методом составляет всего несколько секунд [35]. Метод очень чувствителен, позволяет дифференцировать гомо- и гетерозиготы и оценивать долю SNP при одновременном анализе нескольких образцов [36, 46]. Существуют и другие методы детекции SNPs, использующие современные технологии. Все они обладают большими достоинствами, но требуют специального дорогостоящего оборудования. Секвенирование. Самый точный метод детекции SNP, несомненно, прямое секвенирование интересующего участка генома. Но это дорогой и трудоемкий метод при массовом анализе образцов. Предложено несколько модификаций реакции, снижающих её стоимость, например, секвенирование обеих цепей в одной реакции с использованием двух различно меченых праймеров [69], совмещение ПЦР и секвенирования в одной пробирке сразу для нескольких локусов [50] и другие. Заключение Первыми молекулярными маркерами были маркеры на основе белкового полиморфизма (биохимический полиморфизм, аллозимы). Они оставались единственными молекулярными маркерами вплоть до 1980 г., когда были предложены маркеры, основанные на полиморфизме генетического материала, полиморфизме ДНК. До 1988 г. разнообразие ДНК-маркеров было невелико (ПДРФ и минисателлиты). Но с изобретением ПЦР ситуация изменилась и на сегодняшний день научное сообщество располагает большим количеством самых разнообразных ДНК-маркеров, различающихся по своим свойствам и информативности. На рис.1 в наглядном виде представлена относительная популярность различных молекулярных маркеров с 1966 по 2003 г.г. До 1992 г. наиболее часто используемыми маркерами были ПЦР-ПДРФ маркеры (на рис.1 в ПДРФ-маркеры включены как маркеры на основе анализа ПДРФ, так и на основе ПЦР-ПДРФ-анализа), но затем они уступают первенство микросателлитным маркерам, сохранившим свою популярность до настоящего времени. Параллельно начинают совершенствоваться методы секвенирования ДНК, что способствует их более широкому распространению. RAPD-анализ имел относительно ограниченное распространение в исследованиях мало изученных таксономических групп, наиболее популярен он был с 1992 по 1997 г. С разработкой новых подходов, также позволяющих анализировать геномы без предварительного знания их нуклеотидной последовательности, RAPD-анализ начинает вытесняться AFLP- и ISSR-анализом. И это легко объяснимо, поскольку основное ограничение RAPD-анализа - это его низкая воспроизводимость, что привело к тому, что некоторые журналы (например, Molecular Ecology) не принимают к публикации исследования по биоразнообразию, выполненные на основе RAPD-маркеров (цит. по [75] ). В результате к 2003 году сложилась такая ситуация, когда в научных и прикладных исследованиях используются в основном четыре типа маркеров, полученных на основе микросателлитного анализа, AFLP, секвенирования и SNP-анализа. Особо следует отметить, что быстрое распространение SNP-маркеров в некоторой степени кажущееся, поскольку произошла не только смена технологии, но и смена терминологии. Теперь SNPs включают в себя ПЦР-ПДРФ, SSCP и другие типы маркеров, ранее рассматривавшиеся как самостоятельные группы, многие авторы сюда же включают и секвенирование. Этим объясняется представленное на рис.1 резкое падение популярности ПЦР-ПДРФ маркеров, хотя они по-прежнему достаточно широко применяются как в научных, так и прикладных исследованиях.
Каковы же перспективы на будущее? Развитие науки идет по пути применения высоких технологий, позволяющих одновременно анализировать большой массив образцов путем автоматизации скрининга. Для анализа малоизученных геномов, по-видимому, будут использоваться два подхода: AFLP и ISSR (метод ISSR не представлен на рис.1). Сохранят свое значение при решении конкретных задач методы анализа белкового полиморфизма и рестрикционного полиморфизма ДНК с помощью ПЦР-ПДРФ. Но популярность их, надо полагать, будет низкой и сохранится на уровне 2003 г. В ближайшее десятилетие, скорее всего, использование анализа микросателлитов, как одного из наиболее информативных маркеров будет сокращаться из-за трудностей автоматизации скрининга их аллельных вариантов. Информативность же микросателлитов может быть компенсирована одновременным автоматизированным скринингом на одном образце десятков, сотен и даже тысяч биаллельных SNPs. Этот тип маркеров, по-видимому, будет активно использоваться в ближайшие годы и даже десятилетия. Уже к настоящему времени разработаны высокотехнологичные способы их тестирования: микропанели, использование капиллярных методов разделения ПЦР-продуктов, новых физических методов анализа. Основным ограничением методов массового скрининга SNPs - это высокая стоимость оборудования и реагентов. Конкуренцию SNPs может составить только секвенирование ДНК, несомненно являющееся самым точным и информативным методом анализа полиморфизма ДНК. Ограничением его служит только высокая стоимость анализа. При разработке более совершенных и дешёвых технологий этот подход может стать преобладающим. Таким образом, на наших глазах происходит смена методологии научных исследований: они все более переходят от "штучного" анализа к автоматизированному массовому скринингу образцов ДНК с использованием высоких технологий. http://www.lab-cga.ru/articles/Jornal01/Statia1.htm
|
Маркеры на основе ДНК-зондов
RFLP (ПДРФ-маркеры) — Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов. ПДРФ — оценка полиморфизма длин рестриктных фрагментов ДНК может быть осуществлена разными способами, но наиболее традиционен метод с использованием блот-гибридизации)[1]. Этот метод включает в себя выделение ДНК, получение фрагментов рестрикции, их электрофоретическое разделение, перенос на фильтры с последующей гибридизацией специфических ДНК-зондов с полученными фрагментами ДНК. ДНК-зонд — относительно короткая последовательность клонированной ДНК с определенным уровнем гомологии и способностью гибридизоваться с соответствующим участком геномной ДНК. Комбинации рестриктаз и зондов дают высоко-воспроизводимые полиморфные спектры фрагментов ДНК, специфичные для каждого индивидуума. Различия между последними могут быть обусловлены, например, мутациями, меняющими сайт рестрикции. ПДРФ имеет ряд важных преимуществ, в числе которых высокая воспроизводимость спектров в разных лабораториях, кодоминантное «поведение» маркера. ПДРФ эффективен при картировании генома, маркировании генов многих биологических и экономически важных признаков.
VNTR — (англ. Variable Number Tandem Repeat), метод получил название ДНК фингерпринта (отпечатки пальцев)[2]. Тандемные повторы широко распространены в разных геномах и высокополиморфны. В результате высокой вариабельности этих участков ДНК ПДРФ-анализ с зондами к микро- и минисателитным последовательностям позволяет получать мультилокусные спектры с высоким разрешением на популяционном уровне. Благодаря очень высокому уровню полиморфизма этот подход в настоящее время является хорошим инструментом для анализа внутри- и межпопуляционной изменчивости и определения генетических расстояний между группами организмов. VNTR-аллельные варианты имеют кодоминантный характер наследования.
[править]ПЦР-маркеры
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) предполагает использование специфических праймеров и получение дискретных ДНК-продуктов амплификации отдельных участков геномной ДНК. Большое количество родственных технологий построено на этом принципе. Наиболее широко используемая RAPD технология основана на анализе амплифицированных полиморфных фрагментов ДНК с помощью единичных праймеров с произвольной нуклеотидной последовательностью[3],[4],[5].
SSR — (англ. Simple Sequence Repeats), ПЦР с флангирующими праймерами к короткому мини или микросателитному повтору позволяет выявлять маркеры с кодоминантным наследованием и, соответственно, удобен для выявления гетерозигот по данному локусу. Однако, одна пара праймеров для флангов в ПЦР позволяет рассматривать полиморфизм только одного локуса. Для многих микросателлитных локусов не удается выявить полиморфизм. Как правило, фланкирующие последовательности для данного микросателлитного локуса оказываются видоспецифичными.
RAPD — англ. Random Amplified Polymorphic DNA), полимеразная цепная реакция с использованием единичного короткого, обычно, 10-членным праймеров, с произвольной нуклеотидной последовательностью[6],[7]. Последовательность праймеров не абсолютно любая, а ограничена в пределах 40-70 % GC-состав и 50-100 % лингвистической сложности нуклеотидной последовательности. В RAPD можно использовать как одиночный праймер, так и несколько RAPD праймеров. Продукт RAPD образуется в результате амплификации фрагмента геномной ДНК, фланкированной инвертированной последовательностью используемого праймера. Метод универсален для исследований разных видов, при использовании одних и те же праймеров. Как правило, праймер выявляющий высокий полиморфизм для одного вида, будет также эффективен и для других видов.
ISSR — (англ. Inter Simple Sequence Repeats)[8],[9], специализированный вариант RAPD метода, в котором праймер состоит из микросателлитной последовательности. В этом методе, также как и в RAPD, используется один или несколько праймеров, длиной в 15-24 нуклеотида. Но в данном случае, праймеры состоят из тандемных коротких 2-4 нуклеотидных повторов, например: 5’-CA CA CA CA CA CA CA CA CA G и одним или двумя селективными нуклеотидами на 3’-конце праймера. Продукты ISSR амплификации содержат на флангах инвертированную микросателлитную последовательность праймера. Так как в данном методе последовательность праймеров специфична и подбирается более строго, чем в RAPD, поэтому, температуру отжига в ПЦР можно проводить выше (55-60°С), чем для RAPD метода, а поэтому фингерпринт, обычно, лучше воспроизводим.
AFLP — (англ. Amplified Fragment Length Polymorphism)[10], технология представляет собой комбинацию между ПДРФ и ПЦР методов. AFLP — сложный метод и состоит из нескольких этапов: геномная ДНК одновременно рестрицируется двумя рестриктазами (EcoRI и MseI), узнающими 4 и 6 оснований, соответственно, получая фрагменты с выступающими 3’-концами. Затем рестрицированная геномная ДНК лигируется с адаптором, содержащим «липкие» концы для рестрикционных сайтов (EcoRI и MseI). После этого проводится две последовательных ПЦР. В первой ПЦР (преамплификация) используются праймеры полностью комплементарные адапторам EcoRI и MseI. После первой ПЦР образуется большое количество продуктов амплификации между EcoRI и MseI адапторами, которые трудно дифференцировать с помощью электрофореза. Поэтому, во второй ПЦР, праймеры с EcoRI и MseI адапторами содержат на 3’-конце дополнительные и не комплементарные адапторам от 1 до 3 основания, для селективной амплификации. Разделение фрагментов ДНК выполняется в полиакриламидном геле, с радиоактивной или флюоресцентной меткой, соответственно.
SSAP — (англ. Sequence Specific Amplification Polymorphism)[11] явился модификацией метода AFLP, для выявления полиморфизма как по сайту рестрикции, так и по вставки в геномную ДНК транспозона или ретротранспозона. Геномная ДНК исследуемых образцов расщепляется рестриктазами PstI и MseI, получаются фрагменты с выступающими 3’-концами. Затем рестрицированная ДНК лигируется с PstI и MseI адапторами. Первая полимеразная цепная реакция (преамплификация) проводится с праймерами от PstI и МseIадапторов, то есть амплифицируются все возможные комбинации сочетания этих адапторов в рестрицированной геномной ДНК. После первой ПЦР образуется большое количество продуктов амплификации фрагментов ДНК, локализованных между праймерами и адапторами. ПЦР продукты разбавляются и используются для второй, селективной ПЦР. Вторая ПЦР проводится с меченным праймером к LTR и любым праймером адапторов, либо с PstI или MseI. Во второй ПЦР можно использовать праймеры к адаптору с дополнительными нуклеотидами на 3'-конце, например, один, два или три нуклеотида, не комплементарные адаптору. Электрофорез после второй ПЦР проводят в полиакриламидном геле или в секвенаторе, если использовалась флюоресцентная метка. Продукты амплификации после второй ПЦР образуются в результате амплификации фрагмента ДНК между последовательностью LTR ретротранспозона и адаптором. Получение продуктов амплификации между только LTR последовательностями принципиально возможен, но, как правило, расстояние между двумя ретротранпозонами длиннее обычно получаемых размеров ПЦР продуктов (2500 — 3000 пар оснований). А продукты амплификации между адапторами не будут выявляться, поскольку используется метка только для LTR праймера.
IRAP — (англ. Inter Retrotransposone Amplified Polymorphism)[12],[13], полимеразная цепная реакция между праймерами, комплементарными последовательностям двух рядом расположенных LTR ретротранспозона. Метод имеет несколько вариантов. В первом варианте IRAP используется единичный праймер из LTR. Продукты амплификации образуются между двумя инвертированными LTR с одинаковой последовательностью, то есть в одной цепи 5’-конец одного LTR ориентирован к 3’-концу другого LTR. Если центральная часть ретротрапозона длинее обычного размера ПЦР продуктов (около 3000 пар оснований), то ПЦР будет проходить только между двумя LTR из разных ретротранспозиций. В этом случае соседние LTR должны располагаться в инвертирванном положении. В другом варианте IRAP используются два разных праймера к ивертированным LTR: один праймер с 5’-конца, а другой с 3’-конца LTR, ориентированые в разные стороны от ретротранспозона. В данном случае соседние LTR располагаются как прямые длинные повторы. И, наконец, в третьем варианте IRAP используются праймеры к LTR из разных ретротрапозонов в различной ориентации. Можно комбинировать праймеры из LTR с другими праймерами из повторяющейся ДНК.
REMAP — (англ. Retrotransposone Microsatellite Amplified Polymorphism)[12],[13], полимеразная цепная реакция между праймером к фрагменту LTR ретротранспозона и праймером из рядом расположенного, простого микросателлитного повтора (ISSR праймер). В данном случае позиция амплифицируемого фрагмента ретротранспозона «заякоривается» путем использования праймера к микросателлитному локусу. Например, у растений удобным оказывается использование праймера к LTR и праймера к микросателлиту (5’-CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA G) c единичным селективным нуклеотидом на 3’-конце праймера. В REMAP применяют варианты LTR праймеров как для 5’-конца, так и для 3’-конца LTR, как и в IRAP.
RBIP — (англ. Retrotransposon-Based Insertion Polymorphisms)[14], метод, основанный на использовании праймеров к последовательностям ретротранспозонов и выявляющий кодоминантные аллельные варианты. Его принцип основан на мультилокусной ПЦР, в которой используются пара праймеров, фланкирующих участок ДНК до ретротранспозиции и праймер к LTR ретротранспозона, который встроен в данный участок между первыми двумя праймерами. В результате ПЦР будет амлифицироваться один из вариантов фрагментов, фланкированных парой праймеров, поскольку последовательность между LTR слишком длинная для ПЦР между сайтами геномной ДНК с ретротранспозоном внутри. Этот метод выявляет полиморфизм только для данного полиморфного локуса. К его достоинствам относят кодоминантность полиморфных вариантов, возможность использования для дот-блот анализа большого количества сортов.
iPBS — (англ. inter PBS amplification)[15], метод, основанный на использовании праймеров к PBS (англ. Primer Binding Site, участок связывания тРНК) последовательностям ретротранспозонов. Метод эффективен для выявления полиморфизма между образцами, а также для клонирования новых ретротранспозонов у эукариот.
Однонуклеотидный полиморфизм (SNP).
http://ru.wikipedia.org/wiki/%C4%CD%CA-%EC%E0%F0%EA%E5%F0
Информация по генетическому разнообразию существенна для оптимизации стратегий сохранения и использования ГРЖ. Если возможности сохранения ограничены, часто возникает необходимость определения приоритетов. Принято считать, что новые молекулярные инструменты позволяют идентифицировать гены, участвующие в формировании многих признаков, включая адаптивные признаки, и полиморфизм, приводящий к функциональным генетическим вариантам (QTN – нуклеотиды количественных признаков - Quantitative Trait Nucleotides). Однако у нас нет достаточных знаний для того, чтобы на основании функционального молекулярного разнообразия строить выбор в отношении приоритетности сохранения, до сих пор необходимы альтернативные оценки. Фенотипическое описание обеспечивает грубую оценку средних значений по функциональным вариантам генов, присутствующих у данных индивидуумов или популяций. Однако до сих пор большинство фенотипов большинства домашних видов остаются не оцененными.
Первая роль. В отсутствие надежных фенотипических и QTN данных, или в дополнение к существую-щим данным, наиболее быстрой и рентабельной мерой генетического разнообразия является оценка полиморфизма с использованием анонимных молекулярно-генетических маркеров. При условии, что уникальные популяции, имевшие специфическую эволюционную историю по нейтральным маркерам (например, в связи с изоляцией предков или независимой доместикацией), по-видимому, будут нести уникальные варианты функциональной изменчивости, анонимные маркеры, вероятно, могут дать непрямую информацию о функциональных генах важных признаков. Молекулярные методы оказывают-ся полезными при исследованиях происхождения и доместикации домашних видов и их последующей миграции, а также для получения информации по эволюционным взаимосвязям (филогенетические деревья), и установления географических областей скрещиваний между популяциями, имеющими разное генетическое происхождение. В главе 3.1 представлена схема молекулярных методов оценки генетического разнообразия внутри и между породами.
Вторая роль. Эффективная численность популяции (Ne) является показателем, на основании которого оценивается эффективное число животных в популяции, участвующих в воспроизводстве и вносящих свои гены в следующее поколение. Ne тесно связана с уровнем инбридинга и генетическим дрейфом в популяции и, следовательно, является важным показателем для оценки степени опасности для популяции (см. части A и Е). Традиционные подходы к получению надежных оценок Ne для племенных популяций основываются на родословных или на переписи. В развивающихся странах часто невозможно получить необходимые данные об изменчивости репродуктивного успеха и интервала между поколениями в популяциях. Поэтому молекулярные подходы могут представлять многообещающую альтернативу (подробнее см. в главе 3.2).
Третья роль. Главным приоритетом в управлении ГРЖ является сохранение пород с уникальными признаками. Самое большое значение, особенно для развивающихся стран, имеют способность жить и давать продукцию в критических условиях и обладать устойчивостью к инфекционным заболеваниям.
Адаптация и устойчивость к заболеваниям – комплексные неморфологические признаки, их нелегко измерить. Их можно исследовать в экспериментах, в которых животные подвергаются специфическим средовым воздействиям или инфицируются соответствующими агентами. Однако такие эксперименты трудоемки и дорогостоящи и поднимают вопросы о защите животных. Именно поэтому чрезвычайный интерес исследователей вызывает идентификация генов, контролирующих сложные признаки. Для выявления таких генов используются разные под- ходы.
Краткий обзор молекулярных методов 3.1 Методы, использующие ДНК-маркеры для оценки
генетического разнообразия Маркеры ядерной ДНК
В настоящее время для определения полиморфизма ядерной ДНК в распоряжении имеется ряд разных маркеров. Для изучения разнообразия наиболее часто используются микросателлиты.
Микросателлиты
В настоящее время микросателлиты (вставка 74) являются наиболее популярными маркерами в исследованиях генетических характеристик домашних животных (Sunnucks, 2001). Их высокая скорость мутирования и кодоминантный характер наследования позволяют оценивать внутри и межпородное генетическое разнообразие и генетическое смешивание пород, даже если они близко родственны. В анализ микросателлитных данных определенные противоречия связаны с выбором модели их мутирования – неограниченная (неограниченное появление аллелей, случайно отличающихся по длине - количеству повторов) или пошаговая (последовательное изменение количества повторов) модель мутирования (Goldstein и др, 1995). Однако имитационные исследования показали, что неограниченная модель мутирования, в общем, соответствует оценкам внутривидовой изменчивости (Takezaki, Nei, 1996).Среднее число аллелей в расчете на один локус в популяции, наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность (Ho и He) являются наиболее общими параметрами для оценки внутрипородной изменчивости.Наиболее простым параметром для оценки расхожде-
ния между популяциями является генетическая дифференциация, или индекс фиксации. Предложено
много вариантов оценок (напр., FST и GST), причем наиболее широко используется FST (Weir, Basten,
1990), Которая оценивает степень генетической дифференциации субпопуляций на основании расчета
стандартизированных варианс частот аллелей между популяциями. Для значений FST между парами попу-
ляций может быть оценена статистическая достоверность (Weir, Cockerham, 1984) нулевой гипотезы об
отсутствии генетической дифференциации между популяциями и, следовательно, различий между генетическими структурами популяций (напр., Mburu и др.,2003). Может быть выполнен иерархический анализ
молекулярной дисперсии (пакет программ AMOVA)(Excoffier и др., 1992) для оценки распределения раз-
нообразия внутри и между группами пород.Микросателлитные данные также широко используются для оценки генетических взаимоотношений между популяциями и индивидуумами путем оценки генетических расстояний (например, Beja-Pereira и др., 2003; Ibeagha-Awemu и др., 2004; Joshi и др., 2004; Sodhi и др., 2005; Tapio и др., 2005). Наиболеешироко используемая мера генетического расстояния – стандартное генетическое расстояние Нея (DS)(Nei, 1972). Однако для близко родственных популяций, в которых основным фактором генетической
дифференциации является генетический дрейф, что часто происходит в случае пород домашнего скота,
особенно в развивающихся странах, рекомендуется использование модифицированных расстояний Кавалли-Сфорца (DA) (Nei и др., 1983). Генетические взаимоотношения между породами могут быть выявлены через реконструкцию их филогении, причем наиболее часто используется метод ближайших соседей (neighbour-joining - N-J) (Saitou, Nei, 1987). Однакоглавный недостаток реконструкции филогенетического древа заключается в предположении, что эволюция его ветвей не может образовывать сеть, то есть, ветви могут расходиться, но не могут появляться за счет пересечения. Это предположение редко оказывается справедливым для домашнего скота, где новая порода часто возникает в результате скрещиваний между двумя или более предковыми породами. Таким образом, результаты визуализации эволюции пород, полученные путем реконструкции филогенетических дерев, следует воспринимать с осторожностью.
Для анализа смешения микросателлитных данных из разных популяций предлагаются методы многомерного анализа или недавно появившиеся методы кластеризации на основе подходов Байеса (Pritchard и др., 2000). Вероятно, примером самого всестороннего исследования такого типа у домашнего скота является изучение крупного рогатого скота на всем африканском континенте (Hanotte и др., 2002), которое выявило генетические следы происхождения, вторичных передвижений и дифференциации пастбищного крупного рогатого скота Африки.
Молекулярно-генетические данные, связанные с другими источниками и дополненные, такими как археологические свидетельства и письменные записи, дают полезную информацию о происхождении, дальнейших перемещениях и развитии генетического разнообразия у домашних видов. Картирование происхождения современного генетического разнообразия потенциально позво- ляет делать выводы о том, где может быть найдена функциональная генетическая изменчивость вида, для которого существует только ограниченное количество данных о фенотипической изменчивости.
Объединенный анализ микросателлитных данных, полученных в независимых исследованиях, крайне желателен, но редко возможен. Прежде всего, потому, что большинство популяционно- генетических исследований с использованием ДНК маркеров ограничивается небольшим количеством пород, часто из одной и той же страны (Baumung и др., 2004). Часто используются разные группы маркеров, рекомендованные ФАО, а не генотипирование стандартных наборов во всех проектах. Использование различных микросателлитных систем для генотипирования приводит к различиям в оценках числа аллелей одного и того же локуса в разных исследованиях. Для того чтобы стимулировать использование одинаковых маркеров, ФАО в настоящее время предлагает обновленный, ранжированный список3 микросателлитных локусов для главных видов домашних животных. ФАО рекомендует использовать маркеры в порядке их ранжирования для того, чтобы максимизировать количество маркеров, совместно использующихся в независимых исследованиях. Для некоторых видов доступна ДНК от стандартных животных. Например, аликвотная стандартная ДНК овец и коз, использованная в Эконоген-проекте Европейского Союза (ЕС), распространяется и в других крупномасштабных проек- тах Азии и Африки. Эти образцы могут быть затребованы через Интернет-сайт проекта Эконоген (Econogene Website - http://www.econogene.eu).
Имеется только несколько примеров крупномасштабных исследований генетического разнообразия домашних видов. Hillel и др. (2003) и SanCristobal и др. (2006a) исследовали, соответственно, разнообразие кур и свиней в Европе; Hanotte и др. (2002) получили данные по крупному рогатому скоту практически всего африканского континента; Tapio и др. (2005) оценили разнообразие овец в странах Северной Европы; и Cañon и др. (2006) исследовали разнообразие овец в Европе и на Ближнем и Среднем Востоке. Однако для большинства видов такой всесторонний обзор все еще отсутствует. Продолжающаяся тесная координация между крупномасштабными проектами обещает дать общую оценку генетического разнообразия некоторых видов, таких как овцы и козы, уже в ближайшем будущем. Тем временем развиваются новые методы анализа, позволяющие выполнять мета-анализ наборов данных, которые включают только несколько пород и/или только некоторые общие маркеры. (Freeman и др., 2006). Такая глобальная перспектива оценки разнообразия домашнего скота будет чрезвычайно ценна для воссоздания картины происхождения и истории популяций доместицированных животных и, косвенно, популяций человека. Это также позволит высветить региональные и локальные «горячие точки» генетического разнообразия, на которые могут быть направлены усилия по сохранению.
SNP
SNP (вставка 74) используется в изучении генетического разнообразия как альтернатива микросателлитам. Доступен ряд технологий по выявлению и типированию SNP-маркеров (см. обзор Syvänen, 2001). Будучи диаллельными маркерами, SNP имеют существенно меньшее информационное содержание, и для получения того же уровня информации, какой можно получить при использовании стандартной панели из 30 микросателлитных локусов, необходимо использовать большее их количество. Однако постоянно развивающиеся молекулярные технологии увеличивают автоматизацию и уменьшают стоимость типирования SNP. Похоже, что в ближайшем будущем это позволит выполнять параллельные анализы большого числа маркеров по низкой цене.С такой перспективой выполняются крупномасштабные проекты по ряду видов домашних животных для идентификации миллионов (напр., Wong и др., 2004) и подтверждения нескольких тысяч SNP, для выявления блоков гаплотипов в геноме. Так же как информация о последовательностях, SNP позволяют непосредственно сравнивать и объединять результаты анализа различных экспериментов.
В будущем SNP, по-видимому, будут привлекательными маркерами для изучения генетического
разнообразия, поскольку их легко использовать в оценке и функциональной, и нейтральной измен-
чивости. Однако критической становится предварительная стадия выявления SNP или отбора SNP из
базы данных. SNP могут быть выявлены с использованием различных экспериментальных протоколов,
таких как секвенирование, одноцепочечный конформационный полиморфизм (SSCP) или денатури-
рующая высокоэффективная жидкостная хроматография (DHPLC), или in silico, путем выравнивания и
сравнения множества последовательностей одной и той же области, представленных в публичных базах
данных геномных и экспрессирующихся (EST) последовательностей. Если данные получены для неслучайно сформированных выборок, к ним невозможно применять стандартные оценки популяционно-генетических параметров. Распространенный пример – когда SNPs, исходно идентифицированные в маленькой выборке (панели) индивидуумов, далее типируются на большой выборке хромосом. Такой протокол, предпочтительно отбирая SNP с промежуточными частотами, сместит оценки распределения аллельных частот по сравнению с ожидаемым для случайной выборки. SNP действительно считается перспективным методом для будущего применения в популяционно-генетическом анализе; однако должны быть разработаны статистические методы,
учитывающие особенности каждого метода выявления (Nielsen, Signorovitch, 2003; Clark и др., 2005).
AFLP
AFLP являются доминантными диаллельными маркерами (Vos и др., 1995). Можно оценивать изменчи-
вость одновременно по многим локусам и выявлять единичные нуклеотидные замены в неизвестных
участках генома, в которых может присутствовать неизвестный функциональный ген, несущий данную му-
тацию. Однако неудобством метода является то, что они наследуются доминантно (невозможно отличить
гомозиготу по доминантному аллелю от гетерозиготы); это уменьшает возможности их использования
в исследованиях генетического разнообразия внутри породы и при инбридинге. Тем не менее, профили AFLP высоко информативны при оценке взаимосвязей между породами (Ajmone-Marsan и др., 2002; Negrini
и др., 2006; De Marchi и др., 2006; SanCristobal и др.,2006b) и близкими видами (Buntjer и др., 2002).