6. Микроспектроскопия комбинационного рассеяния

Спектры КР от отдельных участков клетки получают на КР-мик- роспектрометре с тройным монохроматором и фотоэлектронной реги­страцией сигнала. Запись и обработку спектров проводят с помощью компьютера. В качестве источника возбуждения используют аргоно­вый лазер. С целью устранения плазменных линий, расположенных вблизи от возбуждающей линии, перед кюветным отделением помеща­ют предмонохроматор или интерференционный фильтр. Для получе­ния спектров с пространственным разрешением применяют РКР-спект- рометр, состыкованный с оптическим микроскопом. При работе с клет­ками устанавливают водоиммерсионный объектив 100х с числовой аппертурой 0,95. Этот объектив фокусирует лазерный луч в плоско­сти х — у до 1 мкм². Установка диафрагмы диаметром 200 мкм дает пространственное разрешение по оси г, составляющее около 4 мкм. Пространственное разрешение — около 4 мкм³.

7. Метод динамической фазовой микроскопии

В настоящее время для исследования быстрых изменений формы клетки или отдельных ее частей используют лазерный фазовый микро­скоп (рис. 1.10), представляющий собой модифицированный интерфе­ренционный микроскоп с модуляцией фазы референтной волны, с ге­лий-неоновым лазером (А, = 633 нм) для когерентного освещения объекта и диссектором в качестве координатно-чувствительного фото­приемника. Важно, что измерение клеток проводят в отраженном све­те. При регистрации используют объектив х20/0,45, размер поля зрения — 128 х 128 пике (20 х 20 мкм); время измерения в одной точке скан-линии Г,- — 1 мс, время ввода трек-диаграммы — 14,7 с. Микроскоп позволяет получать изображения в виде оцифрованного двумерного распределения фазы h(x, у), которая измерялась в едини­цах длины (оптической разности хода лучей) в реальном времени. Метод динамической фазовой микроскопии основан на периодических измерениях фазы вдоль произвольно установленного сегмента (скан- линии) в-изображении объекта. Полученная при периодическом скани­ровании матрица чисел (трек-диаграмма) содержит информацию об изменениях локальной фазовой высоты в точках скан-линии за время измерений. Накопленные в памяти компьютера данные подвергаются обработке и содержат количественную информацию о флуктуациях локальной разности хода (фазовой высоты) h (х, у), пропорциональ­ной проекции локального показателя преломления п(х, у, z). Как пра­вило, линию сканирования выбирают поперек клетки и производят периодические измерения высоты фазового профиля h(x), где х — координата скан-линии.

Гелий-неоновый лазер

Рис. 1.10. Блок-схема динамического фазового микроскопа

Глава 2 биологические мембраны

Биологические мембраны (лат. membrana — кожица, оболочка, пе­репонка) — структуры, ограничивающие клетки (клеточные, или плаз­матические, мембраны) и внутриклеточные органоиды (мембраны мито­хондрий, хлоропластов, лизосом, эцдоплазматического ретикулума и др.). Мембраны содержат белки, липиды, углеводы, различные макромолеку­лы (гликопротеиды, гликолипиды), а также в небольших количествах коферменты, нуклеиновые кислоты, антиоксиданты, неорганические ионы И т. д.

Биологические мембраны состоят из нескольких молекулярных слоев, суммарная толщина которых обычно не превышает 10 нм.

Предположение о существовании мембран, отделяющих внутреннее содержимое живой клетки от окружающей среды, высказывалось еще в XIX в. На это указывали, в частности, данные о значительных разли­чиях между составом клетки и окружающей среды. В 1890 г. немецкий исследователь В. Пфеффер (W. Pfeffer) предложил термин «клеточ­ная, или плазматическая, мембрана». Однако увидеть и сфотографиро­вать ПМ удалось лишь в 40-е гг. XX в. при использовании электрон­ного микроскопа. В 1935 г. Дж. Даниэлли (J. Danielli) и Г. Давсон (Н. Davson) сформулировали гипотезу двойного липидного слоя, определяющего строение ПМ. В 1964 г. Дж. Д. Робертсон (J. D. Ro­bertson) развил данное представление, сформулировав концепцию асимметричности в строении ПМ. Согласно его теории биологическая мембрана содержит белки, которые связаны электростатически; на на­ружной поверхности БМ находятся гликолипиды. В 1966 г. Дж. Ле- нард (J. Lenard) и С. Сингер (S. Singer) предложили жидкомозаич­ную модель структуры БМ, согласно которой белки «плавают» на по­верхности липидного бислоя в виде глобулярных молекул, погру­женных в БМ. В 1970 г. Г. Вандеркой (G. Vanderkooi) и Д. Е. Грин (D. Е. Green) предложили белково-кристаллическую модель структу­ры БМ; наличие в БМ жесткой белковой структуры обусловлено даль- нодейсгвующими белок-белковыми взаимодействиями. Отметим, что эти представления активно развиваются и сегодня (рис. 2.1). В настоящее время наиболее популярна теория жидкомозаичной мембраны.

Рассмотрим подробнее плазматическую мембрану. ПМ играют важ­ную роль в осуществлении следующих клеточных функций:

D. E. Green и J. Perdue (1966)

Рис. 2.1. Развитие представлений о молекулярной организации биологических

мембран

1. механическая — обеспечивают прочность и автономность клет­ки;

2. барьерная — благодаря полупроницаемое™ обеспечивают се­лективный транспорт и распределение ионов между клеткой и средой;

1. генерация и проведение возбуждения — содержат каналы, об­менники и насосы, обеспечивающие транспорт ионов;

2. энергетическая — обеспечивают синтез АТФ в мембранах мито­хондрий и хлоропластов;

3. матричная — обеспечивают расположение и ориентацию белков и их взаимодействие;

4. адгезивная — обеспечивают межклеточные взаимодействия;

5. двигательная — обеспечивают процесс движения клетки;

6. секреторная — обеспечивают процесс экзо- и эндоцитоза.

Липиды ПМ подразделяют на фосфолипиды, гликолипиды, холе­стерин, триглицерол, стероиды и свободные жирные кислоты. Белки ПМ выполняют ряд функций (клеточное узнавание, рецепция, соедине­ние отдельных комплексов и т. д.) и подразделяются на интегральные и периферические. Интегральные белки пронизывают липидный би­слой ПМ и связаны с фосфоинозитидами. Периферические белки локализованы на поверхности ПМ (ферменты; белки, координирующие форму цитоскелета; белки, связанные с гликокаликсом).

Для ПМ клетки характерно явление асимметрии, при котором рас­пределение и состав липидов на цитоплазматической поверхности мем­браны отличаются от распределения и состава на экстраклеточной. Явление асимметрии ПМ необходимо для:

• поддержания исходной формы клетки;

• фиксации белковой ориентации, способствующей максимальному проявлению их активности (фермент, канал);

• распознавания антигенов;

• регуляции вязкости ПМ;

• обеспечения процесса выведения старых клеток.

В настоящее время рассматриваются несколько общих факторов, регулирующих состояние ПМ. К ним относят действие температуры, состав жирных кислот, содержание холестерина, контакт ПМ с цито­скелетом, действие детергентов, анестетиков и гормонов.

Особый интерес представляют данные о наличии в ПМ специали­зированных областей (доменов). Функциональное значение данных структурных модификаций ПМ заключается в определении различий между апикальной и базолатеральной поверхностями полярных клеток, создании барьеров между апикальной и базолатералыюй мембранами, изменении характера процессов рецепции.