72) Индуцированный мутагенез и понятие о мутагенах.

Мутагенез — это внесение изменений в нуклеотидную последовательность ДНК (мутаций). Различают естественный (спонтанный) и искусственный (индуцированный) мутагенез.

Искусственный мутагенез широко используют для изучения белков и улучшения их свойств. 

Ненаправленный мутагенез

Методом ненаправленного мутагенеза в последовательность ДНК вносятся изменения с определенной вероятностью. Мутагенными факторами (мутагенами) могут быть различные химические и физические воздействия — мутагенные вещества, ультрафиолет, радиация. После получения мутантных организмов производят выявление (скрининг) и отбор тех, которые удовлетворяют цели мутагенеза. Ненаправленный мутагенез более трудоемок и его проведение оправдано, если разработана эффективная система скрининга мутантов.

Направленный мутагенез

В направленном (сайт-специфическом) мутагенезе изменения в ДНК вносятся в заранее известный сайт. Для этого синтезируют короткие одноцепочечные молекулы ДНК (праймеры), комплементарные целевой ДНК за исключением места мутации.

Мутагенез по Кункелю

Для бактериальной плазмиды (внехромосомной кольцевой ДНК) получают уридиновую матрицу, то есть такую же молекулу, в которой остатки тимина заменены на урацил. Праймер отжигают на матрице, проводят его достройкуin vitro с помощью полимеразы до кольцевой ДНК, комплементарной уридиновой матрице. Двухцепочечной гибридной ДНК трансформируют бактериальные клетки, внутри клетки уридиновая матрица разрушается как чужеродная, и на мутантной одноцепочеченой кольцевой ДНК достраивается вторая цепь. Эффективность такого способа мутагенеза менее 100 %.

Мутагенез с помощью ПЦР

Полимеразная цепная реакция позволяет проводить сайт-направленный мутагенез с использованием пары праймеров, несущих мутацию (рис. 1), а также случайный мутагенез. В последнем случае ошибки в последовательность ДНК вносятся полимеразой в условиях, понижающих ее специфичность.

Мутагены

Индуцированными являются те мутации, которые возникают после обработки клеток мутагенными факторами.

Мутагены бывают:

• физические

• химические

• биологические.

Среди физических мутагенов различают ионизирующую радиацию и ультрафиолетовое излучение. Эти факторы ответственны примерно за 10% всех индуцирующих мутаций.

Ионизирующее излучение – рентгеновское излучение (х-лучи), протоны и нейтроны космических лучей, а также альфа, бета и гамма лучи, освобождаемые радиоактивными элементами изотопов (плутония, фосфора 32, углерода 14, водорода 3 и т.д.). Источником ионизирующего излучения также являются радиоактивные отходы ядерных реакторов. Это излучение обладает высокой энергией и может проникать в ткани, в которых сталкивается с атомами и вызывает освобождение электронов, оставляя положительно заряженные свободные радикалы или ионы. Они вызывают дальнейшее освобождение электронов.

Мутагенный эффект этого излучения впервые был показан в нашей стране на микроорганизмах Г. А. Надсоном и Г. С. Филипповым в 1925 году. Позднее он был показан в США на дрозофиле Г. Д. Мёллером.

Уф-излучение характеризуется меньшей энергией, проникает только через поверхностные слои клеток животных и растений не вызывает ионизации тканей.

Обычно различают вида излучения:

• с длиной волны 180-290 нм. Это излучение не найдено в солнечном свете, так как адсорбируется озоновым слоем. Оно продуцируется искусственно бактерицидными лампами, используемыми для стерилизации

• с длиной волны 290-320 нм. Это основная фракция солнечного света. Она мутагена

• с длиной волны 320 нм. Оно также обладает повреждающим эффектом

Это излучение не опасно для половых клеток, но опасно для кожи, т.к. вызывает образование в ней тиминовых диметров, которые вызывают мутации не прямо, а нарушением точности репликации.

Химическими мутагенами являются органические и неорганические кислоты, щелочи, перекиси, соли металлов, этиленамины, формальдегид, фенолы, акридиновые красители, алкилирующие соединения, аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований.

Аналоги оснований включаются в ДНК вместо нормальных оснований в течение репликации ДНК, изменяя её структуру.

На реплицирующую ДНК действуют аналоги азотистых оснований и акридиновые красители.

Многие химические мутагены нарушают процесс мейоза, что приводит к нерасхождению хромосом; а также вызывают разрывы хромосом и генные мутации.

Например, алкилирующие соединения могут входить в состав лекарственных препаратов, поэтому при их приеме и в течение 3 месяцев после окончания лечения необходимо избегать зачатия.

Биологическими мутагенами являются вирусы, которые вызывают хромосомные аберрации в культивируемых клетках, например, вирус гриппа.