44. Пцр в реальном времени

• Чувствительные средства измерения количества РНК

• Не широкогеномные: используется для проверки результатов микрочипов

• TaqMan метод использует флуоресцентно меченые праймеры

• Флуоресцентной метка обрезается полимеразой Taq

ПЦР в реальном времени является еще одним способом для измерения изобилия РНК. В настоящее время доступны real-time ПЦР машины, каждая из которых измерить только 96 уровней РНК одновременно, так что этот метод не может считаться широкогеномным анализом. Тем не менее, ее чувствительность выше, чем у микрочипов, и это гораздо дешевле, чем MPSS, поэтому она играет важную роль как средство проверки экспрессии генов обнаруженой другими способами, такими как микрочипы. Есть несколько различных методов, используемых в ПЦР реального времени, но все они основаны на флуоресцентном сигнале исходящем в процессе ПЦР-амплификации.TaqManReg метод, как показано на слайде, использует флуоресцентную метку на праймере. Когда полимераза Taq прибывает на праймер, она обрезает флуоресцентную метку что позволяет ей высвобождать энергию. Это флуоресценция регистрируется с течением времени.

45. Считывание пцр в реальном времени

• Считывания real-time ПЦР представляет собой набор кривых

• Кривые показывают цикл ПЦР, при котором обнаружена флуоресценция

• Каждый цикл в два раза больше предыдущего цикла

Считывания real-time ПЦР представляет собой набор кривых, что характеризуют отношения уровня флуоресценции к циклу ПЦР. Потому что ПЦР приводит к экспоненциальной амплификации ДНК, каждый цикл представляет в два раза больше увеличенный продукт, чем его предшественник.. На рисунке на этом слайде, ПЦР реального времени используется для обнаружения спор, которые могут быть использованы в биологической войне.Кривая слева указывает на споры, чьи показатели больше чем в 1000 раз больше, чем споры чья кривая справа.

46. Геномный анализ генной экспрессии

• Методы способные дать "снимок" экспрессии РНК всех генов

• Может использоваться в качестве диагностического профиля

- Пример: диагноз рака

• Можно показать, как изменится уровень РНК в процессе развития, после воздействия стимулов, во время клеточного цикла и т.д.

• Предоставляет большое количество данных

• Может помочь нам начать понимать, как функционируют целые системы 

Геномные методы определения экспрессии генов обсуждаемые в этой главе способны дать снимок экспрессии для всех генов. Как мы видели, потенциально очень мощное использование этих методов для диагностики таких заболеваний, как рак. Другим применением является демонстрация, как меняется экспрессия генов в процессе развития, после воздействия стимулов, в ходе клеточного цикла и т. д. Большое количество данных, который создается с помощью этих методов требует новых вычислительных методов ее анализа. Эти и другие геномные подходы начинают позволять нам понять, как функционируют целые биологические системы.

47. Выводы

• Microarrays

- сравнение с Нозерн Блотт

- как создаются

- как используются

- различия между spotted и олигонуклеотидными microarrays

- примеры экспериментов с microarrays

• SAGE

• MPSS

• Real-time PCR

Таким образом, мы начали эту главу с обсуждения Нозерн Блотт и чем он отличается от микрочипов. Затем мы обсуждали, как микрочипы производятся и как они используются. Мы указали на некоторые различия между spotted кДНК и олигонуклеотидными микрочипами. Мы привели примеры экспериментов, которые использовали оба типа микрочипов. Мы также описали SAGE и MPSS методы, а также ПЦР реального времени.