34. Affymetrix GeneChip эксперимент

• РНК извлеченные из различных типов опухолей головного мозга

• Извлеченые РНК гибридизованы с GeneChips содержащими примерно 6800 генов человека

• Определены профили экспрессии генов специфичные для каждого типа опухоли

Пример использования Affymetrix GeneChips была попытка для определения того могут ли быть различия в экспрессии генов использованы для диагностики опухолей головного мозга. РНК выделяли из биопсий из четырех различных типов опухолей головного мозга.Меченная цель была гибридизована с GeneChips, которые содержали около 6800 генов человека. Профили экспрессии были проанализированы с целью выявления закономерностей, которые были специфичные для каждого типа опухоли.

35. Профилирование опухолей

• Изображение изображает профили экспрессии генов с указанием различий между различными опухолями

• Опухоли:

• MD (медуллобластомой)

• Mglio (злокачественной глиомы)

• Rhab (палочковидный)

• PNET (примитивная нейроэктодермальная опухоль)

• Ncer: нормальный мозжечок

В верхней части изображения приведены четыре различные типа опухолей: медуллобластомы (MD), злокачественные глиомы (Mglio), палочковидные (Rhab), и примитивные нейроэктодермальные (PNET). Гены, которые имели паттерны экспрессии специфичные для каждого вида опухоли перечислены вдоль вертикальной оси. Цвета обозначают интенсивность чтения из GeneChips, с красными самая высокая интенсивность и фиолетовые - низкая (показан на панели в нижней части изображения). Алгоритмы, используемые для кластеризации генов описаны в главе, посвященной биоинформатике. Очень четкие различия были обнаружены в профилях экспрессии четырех типов опухолей.

36. Диагностика рака с помощью microarray

• Экспрессия генов отличается, для медуллобластомы коррелирует с ответом на химиотерапию

• Те, кто не отвечает имеют другой профиля от выживших

• Можно использовать этот подход для определения лечения

Более подробный анализ был выполнен теми же авторами для одного типа опухоли, медуллобластомы. РНК из 60 различных образцов опухолей было проанализировано.Ответ на химиотерапию был известен для каждого из опухолей. Анализ профилей экспрессии генов показал, что можно было соотносить конкретные паттерны экспрессии генов с ответом на химиотерапию: Пациенты, которые не реагировали имели другой профиль экспрессии по сравнению теми, кто отреагировал и прожил дольше. Этот результат показан на графике в верхней части изображения и кластерные профили экспрессии под ним. Этот тип анализа обещает, что в будущем, микрочипы могут быть использованы для определения того, какие опухоли могут реагировать на различные виды лечения.

37.Анализ результатов microarray

• Неотъемлемая изменчивость: необходимость повторения

• Биологические и технические воспроизведение

• Анализ алгоритмов

• На основе статистических моделей

• Средства генерации гипотез, которые должны быть проверены

Особенностью всех платформ микрочипов является их собственная изменчивости от эксперимента к эксперименту.Изменчивость возникает отчасти изза изменения количества и качества каждого зонда, особенно для spotted микрочипов. Даже для олигонуклеотидов, созданных фотолитографией, могут быть различия в их изготовлении. Но изменчивость может также возникнуть в результате различий в обилии РНК изза стохастических или экологических факторов. По этим причинам, важночтобы все экспериментов с микрочипами повторялись несколько раз. Есть два типа воспроизведения: биологические и технические. В биологических повторах, весь эксперимент повторяется, в то время как в технических повторах та же меченая цель используется в двух различных микрочипах. Техническое воспроизведение может быть полезным в выявлении производственных дефектов микрочипов. Биологическое воспроизведение имеют важное значение для выявления изменений, которые вытекают из некоторых аспектов биологического процесса при изучении. Есть несколько различных алгоритмов, используемых для анализа результатов микрочипов. Некоторые из них разработаны специально для конкурентных экспериментов по гибридизации, в то время как другие предназначены для одного эксперимента гибридизации. Все они основаны на статистических моделях и предназначены для выявления существенных различий в экспрессии. В конечном счете, эксперименты с микрочипами следует рассматривать как средство получения гипотез, которые должны быть проверены с помощью независимых подходов. После того, как ген или гены, были определены с определенным профилем экспрессии, другие методы, такие как ПЦР в реальном времени, могут быть использована для проверки экспрессии. Тогда обратные генетический подходы могут быть использованы для определения влияния изменения характера экспрессии гена на фенотип организма.

38. SAGE

• Серийный анализ экспрессии генов

• Концепция: последовательности маленьких кусочков каждой кДНК в библиотеке

- Дает степень обилия каждого вида РНК

• Метод

- Отрезание "метки" от каждой кДНК

- Лигирование тегов вместе в конкатемер

- Последовательность конкатемера

Есть несколько других способов получения профиля экспрессии всего генома. Два таких метода, как SAGE (серийный анализ экспрессии генов) и MPSS (Massively Parallel Signature Sequencing). Оба включают шаг, который требует секвенирования ДНК. Сейчас мы дадим краткий обзор обеих процедур. Основная концепция SAGE в том, что обилие различных РНК в образце может быть определена путем секвенирования кДНК каждой из РНК. В SAGE, вместо сиквенса всей кДНК, достаточно лишь секвенировать что бы однозначно идентифицировать его.

39. SAGE

• Раскол кДНК рестриктазой,  разрезающей четыре основания

• Лигирование адаптеров содержащих сайт для рестриктазы типа II

• Вырезние 14 пар оснований от сайта узнавания

Эта процедура выполняется начинается с отрезания "метки" в 14-п.о. в конце каждой кДНК, лигирования этих тегов вместе, а потом сиквенса образовавшегося конкатемера.К кДНК прикрепляются полиА хвостами к твердому носителю (например, магнитные шарики), а затем разрезаются рестрикционным ферментом, который имеет четырехнуклеотидный сайт узнавания и, следовательно, режет довольно часто. Адаптеры лигируют с липкими концами.Адаптеры содержат сайт узнавания для рестриктазы типа II , который отщепляет 14 пар основ от сайта узнавания. Расщепление с помощью рестрикционных ферментов приводит к высвобождению коротких сегментов ДНК, которые состоят из адаптеров плюс 14 пар оснований, прилегающих к ним.

40. SAGE

• Лигирование на адаптерах с рестрикционными сайтами

• Разрезание с двумя ферментами рестрикции для освобождения тега в 26 пар оснований

• Лигирование тегов вместе в конкатемер ~ 500 пар оснований

41. SAGE

• Сиквенс конкатемера

• Определение границ тегов

- размер тегов и сайтов рестрикции

• сравнение последовательностей тегов с базами данных

• Обилие тегов – степень обилия, исследуемых видов РНК

Конкатемеры являются последовательными и границы каждой метки идентифицируются с помощью программного обеспечения, которое признает четырех-основный сайт рестрикции и длину тега. Последовательности отдельных тегов затем сравниваются с известными последовательностями 3’ – нетранслируемых участков генов исследуемого организма. Относительное содержание каждого тега рассчитывается и принимается в качестве меры уровня экспрессии соответствующего гена.

42. MPSS

• Massively parallel signature sequencing

• Средство определения численности видов РНК

• Уникальный теги добавляются в кДНК

• Теги гибридизируются с олигонуклеотидами на микрошариках

MPSS, разработанная Lynx Therapeutics, Inc, похожа на SAGE в том, что обилие РНК основано на том, сколько раз конкретная последовательность кДНК находится. В отличие от SAGE, она включает в себя шаг гибридизации и сиквенс выполняется следующим образом: после того, как кДНК сделана, уникальный тег добавляется к каждой кДНК. Это метки, которые затем гибридизируются с микрошариками, которые имеют дополнительные короткие олигонуклеотиды, связанные с ними.микрошарики затем помещаются в специально разработанную стеклянную камеру для реакции сиквенса. Продукты реакции секвенирования детектируются с помощью специально разработанного инструмента (показано на рисунке).

43. MPSS

• Секвенирование осуществляется в стеклянной камере

• Инициированное ферментами рестрикции выявление четырехнуклеотиодного довеска

• Гибридизация четырехнуклеотидных адаптеров используется для чтения последовательности

• Количество раз, когда определенная последовательность найдена является мерой обилия РНК

Микрошарики помещают в стеклянную камеру предназначеную для обеспечения реакций секвенирования , это должно быть выполнено на всех прилагаемых кДНК одновременно.Реакция инициируется расщеплением рестриктазами. Затем адаптер может отжигатся на этот сайте.Адаптер содержит четырехнуклеотидный сайт узнавания для типа рестриктаз IIго типа , которые отрезают на определенное количество оснований от сайта и оставляет четырехнуклеотидный свес. На данном этапе, специальные "закодированных адаптеры", которые содержат все возможные четырехнуклеотидные комбинации могут скрещиваться с свесом. Гибридизация детектируют с помощью MPSS инструмента, после чего новые ресриктазные адаптеры добавляются и срезают четыре нуклеотида , оставляя следующие четыре основания До 1,000,000 реакции секвенирования могут быть выполнены одновременно используя этот метод.Реакции секвенирования могут читать только 16-20 оснований, но это число является достаточным для однозначной идентификации соответствующего гена. Как и SAGE, обилие небольших короткой последовательности указывает на уровень экспрессии соответствующего гена. В изображении на этом слайде изображены различные последовательности прочитанные MPSS с их содержанием справа. Основное преимущество MPSS том, что она более чувствительна к РНК низкой численности, чем микрочипы. Его основной недостаток в том, что каждый эксперимент является очень дорогостоящим (в настоящее время более чем $ 25.000).