18. Фотолитография

• Химическая реакция, активирующаяся светом

- для добавления основ к олигонуклеотиду

• Маски (фильтры)

- предотвращают прохождение света в те места ,где не нужно присоединение определенного нуклеотида

• Так же используются зеркала

- NimbleGen ™ использует этот подход

В фотолитографии, каждый шаг процесса синтеза олигонуклеотидов активируется с помощью света. В процессе производства Affymetrix, маски используются, чтобы позволить основаниям быть добавленым к растущей олигонуклеотидной цепи в определенных местах на чипе.Маски предотвращают попадание света в те места на кремниевой пластине, где основание не следует добавлять, в этом раунде. Вместо масок, с цифровым управлением могут быть использованы зеркала, чтобы свет попадал только на те места, где требуется активация.Биотехнологическая компания, NimbleGen ™ использует этот подход для создания чипов посредством фотолитографии.

19. Пример: постройка олигонуклеотидов с помощью литографии

• Нужно добавить нуклеотид G

• Фильтр (маска) закрывает все остальные места на чипе

• Свет светит только в те места, где нужно добавление G

• G добавлен

• Теперь G на олигонуклеотиде

Чтобы понять, как работает фотолитографии с маской мы используем пример добавления основания G. маска используется, что мешает попаданию света во все части олигонуклеотидной цепи на чипе, где G не должна быть  Когда свет включен, он достигает только тех позиций, где G должен быть добавлен.Свет активизирует растущую цепь, позволяющие основанию быть добавленым. Раствор, содержащий основание G будет добавлен в чип, и он привяжется к олигонуклеотидной цепи активируясь светом.

20.еще пример того же

нужно итого около 80 масок-фильтров

21. Струйная печать микрочипов

• Струйные печатающие головки наносят ДНК

• Печатающая головка перемещается в определенное место на твердом носителе

• ДНК выбрасывается через небольшое отверстие

• Используется для обнаружения ДНК или синтеза олигонуклеотидной цепи непосредственно на стекле

• Использовано впервые Agilent Technologies, Inc

Другой метод для нанесения ДНК на стекло является использование технологий струйного принтера. Струйные принтеры предназначены для нанесения очень малых количеств чернил в точное место. Технология адаптирована для микрочипов, печатающая головка наносит небольшое количество ДНК, движется к определенной точке на чипе, и выпрыскивает ДНК через очень маленькое отверстие. Эта технология была также адаптирована для обеспечения синтеза олигонуклеотидов на чипах. После каждого основания добавляемого через печатающую головку на растущую олигонуклеотида, микрочип отмывают от избыточных нуклеотидов, а открытые основы нацелены на добавление следующего нуклеотида. Agilent Technologies является пионером в использовании струйной печати для изготовления микрочипов. Основной недостаток данного подхода по сравнению с фотолитографии является то, что максимальное количество ячеек на чипе гораздо меньше со струйной печатью ДНК.

22. Сравнение микрочипов

На этом слайде сравниваются три способа получения микрочипов. На верхней панели показана фотолитографии, средняя панель иллюстрирует механическую печать и нижняя панель иллюстрирует струйную печать.

23.Сравненеи гибридизации

• Капельные микрочипы

- конкурентная гибридизация

- две меченные кДНК гибридизовались в той же ячейке

• Affymetrix GeneChips

- одна меченая РНК популяция на чип

- Сравнение между интенсивностью гибридизации тех же олигонуклеотидов на разных чипах

In addition to the differences in their manufacturing, spotted microarrays and GeneChips (as well as NimbleGen chips) differ in how the hybridization is performed. For spotted microarrays, usually the two labeled targets to be compared are hybridized to the same microarray. This procedure is known as competitive hybridization. For GeneChips, only one labeled target is hybridized to each chip. Comparisons are made at the analysis stage between hybridization intensities measured on two different chips. With competitive hybridization, one is measuring the relative difference between the signal intensity of two targets binding to the same spot of DNA. The practical reason for this approach is that there is often variability in the quality of the spotted DNA, in terms of amount and integrity. This measurement compensates for differences in the quality of the spot. Microarrays made with photolithography tend to have higher reproducibility from slide to slide, making competitive hybridization less important.

В дополнение к различиям в их производстве, замечено, что микрочипы и GeneChips (а также NimbleGen чипы) отличаются тем, как гибридизация выполняется. Для капельных микрочипов, как правило, сравниваемые две маркированные цели гибридизуют на тот же микрочип. Эта процедура известна как конкурентная гибридизация. Для GeneChips, только одна помеченная цель гибридизуется с каждым чипом. Сравнение производится на этапе анализа между интенсивностью гибридизации , измеренной на двух разных чипах. С конкурентной гибридизацией, одно измерене относительной разницы между интенсивностью сигнала двух целей связаннных на том же месте ДНК.Практической причиной для такого подхода является та, что нередка вариабельность в качестве капли ДНК, с точки зрения количества и целостности. Это измерение компенсирует разницу в качестве капли. Microarrays сделанные с помощью фотолитографии, как правило, имеют более высокую воспроизводимость от чипа к чипу,  что делает конкурентную гибридизацию менее важной.

24. Маркировка цели: флюоресцентная кДНК

• кДНК с использованием обратной транскриптазы

• добавлены флуоресцентно меченые нуклеотиды

• Меченые нуклеотидов включены в кДНК

Маркировка РНК-мишени, как правило, осуществляется путем создания одноцепочечной кДНК, с помощью фермента обратной транскриптазы. Один из способов маркировки - использование флуоресцентно меченых нуклеотидов, которые включены в ДНК во время реакции обратной транскрипции. Обычно это путь нуклеотидов, меченных красителями Cy3 и Cy5 включенными в цели , использующиеся  в конкурентной гибридизации.

25. Маркировка цели: cRNA + биотин

• кДНК, созданная с помощью обратной транскриптазы

• добавляется линкер с сайтом узнавания Т7 РНК-полимеразы

• T7-полимераза добавляется и меченные биотином РНК основания

• Биотиновые метки включены в кРНК

Другой альтернативой для маркировки целевых групп  РНК создание двухцепочечной кДНК,, а затем использование вирусной РНК-полимеразы, чтобы сделать кРНК. Чтобы выполнить эту задачу, линкер будет добавлен в кДНК,, который содержит сайт узнавания для РНК-полимеразы (например, T7 РНК-полимеразы). Маркировка осуществляется путем добавления модифицированных РНК оснований в реакцию с РНК-полимеразой. Этот вид маркировки используется для GeneChips Affymetrix а также NimbleGen чипов.Производство кРНК использованием T7-полимеразы включает в себя амплификацию исходной популяции РНК.

26. Метки

• Cy3 и Cy5

- флюорисцируют при разных длинах волн

- используются для конкурентной гибридизации

• Биотин

- привязан к флюоресцентно меченному авидину

- Используется с Affymetrix GeneChips

27. Spotted-microarray гибридизация

• Меченные контрольные и экспериментальные ДНК

- один образец мечен Cy3

- другой образец мечен Cy5

• Оба образца гибридизируются вместе на микрочипе

• Отностительную интенсивность излучения определяют с помощью конфокального лазерного сканера

28. Сканирование microarray

• Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

• Лазерный луч возбуждает каждое пятно ДНК

• Детектируется интенсивность флюоресценции

• Разные лазеры используются для различной длины волн:

- Cy3

- Cy5

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия используется для определения количества флуоресцентно меченые целей, которые гибридизованы с ДНК на микрочипах. В этом процессе лазерный луч, направлен на каждое пятно на микрочипов,.Флуоресцентный свет, который испускается при возбуждении красителя проходит через отверстие, которое эффективно устраняет все окружающее освещение. Это условие позволяет точно определить уровень флуоресценции гибридизированных целей на одном месте на микрочипе. Для конкурентной гибридизации микрочипы сканируется дважды, с использованием различных длин волн для каждого из флуоресцентных красителей Cy3 и Cy5.