8. Нозерн блот/микрочипы

Глобальный анализ экспрессии: микрочипы

Уровень РНК каждого гена в геноме проанализирован в параллелях

Глобальный анализ экспрессии: Нозерн блот

Ограничено число дорожек в геле

Микрочипы позволяют одновременно анализировать экспрессию РНК тысяч генов. Микрочипы могут быть использованы для анализа экспрессии каждого гена по всему геному. Нозерн блот, с другой стороны, ограничивает количество дорожек на геле и на количество зондов, которые могут быть использованы на той же дорожке. Нозерн блот обычно имеет 20-40 дорожек, и одновременно не можно использовать более трех зондов. Таким образом, микрочипы увеличивают пропускную способность на несколько порядков.

9. Основы метода микрочипов

ДНК прикреплены к твердой подложке из стекла, пластика или нейлона

РНК помечена Обычно косвенно

Связанная ДНК это проба

Меченая РНК является "целевой"

Еще одно различие между микрочипами и Нозерн блотом в том, что в микрочипах ДНК прикрепляется к твердой подложке, которая может быть стеклом, пластиком, или нейлоновой мембраной, в то время как РНК помечена непосредственно или через кДНК. Таким образом, на микрочипах, связанная ДНК находится в избытке. В соответствии с терминологией Нозерн блота, для микрочипов связанную ДНК называют «зонд», а меченую РНК или ДНК, называют "мишенью".

10. Гибридизация на микрочипах

Обычно сравнительная

Соотношение между двумя выборками

Примеры

Опухоль по сравнению с нормальной тканью

Медикаментозное лечение по сравнению с отсутствием лечения

Эмбрион по сравнению со взрослыми

Большинство микрочиповых экспериментов сравнивают популяции РНК, находящиеся в двух разных образцах. Образцы могут быть нормальной тканью и тканью опухоли, клетками, которые получили лечение от наркозависимости и клетками, которые не получили его, клетками в двух различных точках клеточного цикла и т.д.

11. Как микрочипы производятся: нанесение пятен на микрочипы

ДНК механически размещены на стекле

Объем: Используюся нано- и пиколитры

Слишком малый объем для нормального устройства пипетирования

Робот точечно наносит ДНК в определенных местах

Для производства микрочипов используются различные технологии. Наиболее часто используемыми технологиями для микрочипов являются механические нанесение пятен и фотолитография. Механическое нанесение пятен включает в себя размещение очень малых количеств ДНК на стеклах. Объемы жидкости, в которой растворена ДНК измеряются в диапазоне от нанолитров до пиколитров, который слишком мал для нормального устройств пипетирования. Роботы были адаптированы для работы на этих небольших объемах и "капают" или "печатают" их в точно определеных местах на предметных стеклах.

12. Точечное нанесение ДНК

Для нанесения ДНК обычно используется одновременно несколько контактов

ДНК в микролитровых плашках

ДНК обычно амплифицируется ПЦР

Олигонуклеотиды также можно наносить

Большинство роботов для нанесеня используют контакты, которые действуют под действием капиллярных сил и похожи на перьевые ручки. Многочисленные контакты смонтированы вместе и одновременно разносят ДНК аликвоты в разные лунки плашки.ДНК в лунках, как правило, была амплифицирована от кДНК или геномной ДНК с помощью ПЦР. Олигонуклеотиды также могут быть нанесены таким же образом.

13. Точечное нанесение ДНК

Контакты окунаются в раствор ДНК в микролитровых лунках

Робот перемещает контактов с ДНК к слайдам

Робот "печатает" ДНК на слайде

ДНК прикрепляется к слайду гидростатическим взаимодействем

Одни и те же пятна обычно печатаются в разных местах

Это служит в качестве внутреннего контроля

Контакты промывают между раундами печати

Сотни слайдов могут быть напечатаны в день

После погружения контактов в раствор ДНК в лунках, робот перемещает контакты к набору предметных стекол микроскопа. Она приносит контактов в контакт с горкой, и ДНК палочки через гидростатический взаимодействия.Робот возвращается в лунки, составляет более ДНК, и выводит его на следующем слайде. Обычно же ДНК печатается в более чем одном месте на том же слайде. Это повторение выступает в качестве внутреннего контроля равномерности реакции гибридизации. После завершения печати для одного набора ДНК, контакты промывают и процесс начинается снова со следующим набором ДНК. Коммерческая корректировщиков может работать с несколькими пластинами микротитровальных и может печатать сотни слайдов в день.

(Далее: некоторые подписи переведены неточно из-за сложностей с переводом названий. Некоторые подписи не переведены, т.к. являются неинформативным копипастом со слайда.)

14., 15 – иллюючтрации и видео приборов, наносящих образцы на микрочипы

16. Как делают микрочипы

• олигонуклеотиды синтезирубтся на силиконовом чипе

- одновременно одно основание

• используется процесс фотолитографии

- разработан для печати компьютерных микросхем

Синтез олигонуклеотидов прямо на твердый носитель был впервые придуман  Affymetrix ®.Синтез осуществляется с помощью фотолитографии, процесса, который используется для печати компьютерных схем, отсюда и название для микрочипов Affymetrix: " GeneChips ®"

17. Affymetrix GeneChips

• Олигонуклеотиды

- Обычно 20-25 основ длиной

- 10-20 различных олигонуклеотидов для каждого гена

• Олигонуклеотиды для каждого гена выбраны с помощью компьютерной программы, так чтобы они были следующими:

- Уникальными в геноме

- Неперекрывающимися

• Композиция основывается правилах проектирования

- эмпирическим путем

На GeneChips Affymetrix существует от 10 до 20 олигонуклеотидов для каждого гена.Выбор олигонуклеотидов определяется с помощью компьютерной программы, которая ищет неперекрывающиеся участки длиной 20-25 основ, которые являются уникальными в геноме (в целях предотвращения перекрестной гибридизации). Кроме того, компьютер ищет олигонуклеотиды, которые будут соответствовать эмпирическим правилам проектирования, которые определяют отношение G-C пар по сравнению с А-Т парами, что есть попыткой уменьшить вероятность того, что олигонуклеотид гибридизуется с собой, создавая шпильки