5. Гибридизация

Измерения количества РНК микрочипами на основе гибридизации

Между комплементарными нитями ДНК и РНК

Или двумя комплементарными нитями ДНК

Принцип похож на РНК-блот (Нозерн)

Способность микрочипов измерять уровень экспрессии РНК зависит от гибридизации между комплементарными нитями ДНК или РНК и ДНК. Гибридизация основана на комплементарности нуклеотиднов аденина и тимидина , цитозин и гуанина. При благоприятных условиях это мпаривание основ может быть использовано для определения различия между последовательностями, которые очень похожи друг на друга. Использование гибридизации для измерения количества РНК было впервые разработано для техники, известной как Нозерн блот (РНК блот). Гибридизация микрочипов похожа на Нозерн блот (РНК блот), основное отличие в том, что микрочипы позволяют определить уровни экспрессии и многих других генов.

6. Нозерн блот

Электофорез РНК в геле

Перенос РНК на твердую подложку

Нейлоновую или из нитроцеллюлозы

Интенсивность сигнала гибридизации, примерно соответствует количеству РНК.

В нозерн блоте, образцы РНК (из разных тканей, различные моменты времени и т.д.) вносятся в агарозный гель.Создается электрическое поле в геле, в результате чего отрицательно заряженные молекулы РНК перемещяются через гель в сторону положительного электрода. Этот процесс электрофореза приводит к разделению популяйии молекул РНК в зависимости от размера. Чем большая молекула РНК, тем большее сопротивление она встречает при прохождении через гель, по сравнению с меньшими молекулами РНК, в результате чего более крупные молекулы, в результате большие молекулы медленнее движутся в геле. Как только было получено достаточное разделение РНК, гель приводят в контакт с нейлоновой или нитроцеллюлозной мембраной. Капиллярные явления, используемые для перемещения РНК из геля на мембрану, сохраняют пространственное разделение РНК. Мембрана затем обрабатывается, чтобы вызвать крепкое связываются с ней РНК. Следующие шаги связаны с гибридизации меченого зонда с РНК. Зонд - обычно ДНК, которая была модифицирована таким образом, что она содержит радиоактивный изотоп или эпитопы, которые будут реагировать с антителом. Меченую ДНК добавляют к мембране, содержащей разделенные РНК. Гибридизация происходит в специальных условиях, которые обычно включают в себя небольшие объемы жидкости, при умеренно высоких температурах и низких концентрациях соли. Эти условия разработаны, чтобы позволить зонду найти комплементарную ему РНК, которая по-прежнему связана с мембраной или бумагой. После того, как гибридизация произошла, избыток несвязанных зондов смывается.

7. Гибридизация, моменты

целостность РНК должна быть проверена

Если РНК деградировали, гибридизация не является количественной

Зонд должен быть в избытке по отношению к связанной РНК

кинетика гибридизации управляет реакцией

Гибридизация должна проходить в течение достаточного времени, чтобы зонд нашел РНК-мишени

Сравнение образцов требует контроля загрузки

Для того, чтобы точно определить относительное количество РНК, при выполнении Нозернблота должны быть соблюдены некоторые условия. Во-первых, необходимо проверить целостность РНК. Если РНК частично деградировали, интенсивность гибридизации не будет точно отображать количество РНК в исходном образце. Во-вторых, Зонд должен быть в избытке по отношению к связанной РНК. Если нет, то количество связей будет отражением количество введенных веществ в смесь гибридизации, и возникнет конкуренция между комплементарными РНК в различных положениях блота. В-третьих, должно пройти достаточно времени, чтобы зонд связался с комплементарной ДНК. Наконец, независимыми методами нужно показать, что РНК были загружены в каждую дорожку геля примерно в равных количествах. Эта задача обычно выполняется с помощью второй пробы комплементарной к РНК, которая находится в равных количествах в различных РНК. Этот контроль нагрузки также может быть использован для нормализации интенсивности гибридизации путем корректировки расхождений в количестве РНК в каждой дорожке.