1. Глава 5

Анализ экспрессии РНК

Определение уровня экспрессии РНК в геноме

Эта глава охватывает геномные технологии, с помощью которых можно измерить уровни экспрессии ДНК всех генов в геноме.

2. Содержание

Анализ экспрессии РНК в-целом по геному

Нозерн – блот

Типы микрочипов

Как делать микрочипы

Гибридизация в микрочипах

Эксперименты с использованием микрочипов

SAGE

MPSS

ПЦР в реальном времени

Эта глава включает введение в анализ экспрессии РНК в-целом по геному, обсуждение метода нозерн – блот – наиболее широкоиспользованной пре геномной технологии для измерения уровней экспрессии РНК. Далее описывается несколько различных типов микрочипов, которые доступны на сегодня, как их делают и как делают гибридизацию на микрочипах. Предоставлены примеры результатов экспериментов с использованием микрочипов. Описываются и другие геномные технологии, которые используются для измерения количества РНК, в т.ч. SAGE (серийный анализ генной экспрессии), MPSS (массивный параллельный сиквенс отпечатков) и ПЦР в реальном времени.

3. Анализ экспрессии генома

После определения всех генов в геноме можно измерить экспрессию каждого гена. Для этого первым делом определяют стационарное количество РНК каждого гена. Продолжаются попытки измерить уровень всех белков. (См. глава по протеомике). Уровни РНК очень зависят от типа клеток, стадии развития, влияния окружающей среды и тд. Например, РНК, экспрессирующиеся в клетках сердца сильно отличаются от РНК клеток мозга; РНК, экспрессирующиеся в эмбриональной крови отличаются от таковых в крови взрослых. К тому же, воздействие высоких температур вызывает появление РНК белков теплового шока, которые не присутствуют при нормальных условиях. Таким образом, определение уровня РНК найденных в определенное время и в определенной клетке или органе может предоставить важную информацию о функциях генов, ответственных за эту экспрессию. Кроме того, спектр или профиль РНК найденных в определенной клетке может быть использован как средство диагностики заболеваний. Например, было показано, что различные виды рака имеют различные профили РНК. (См. пример далее в этой главе.)

4. Методы анализа геномной экспрессии

Микрочипы

Основанные на гибридизации

SAGE (серийный анализ генной экспрессии), определение последовательности фрагментов кДНК

MPSS (массивный параллельный сиквенс отпечатков). Совмещает гибридизацию и сиквенс

ПЦР в реальном времени

Есть несколько различных способов, которые были разработаны для определения уровней экспрессии РНК во всем геноме. Наиболее часто используемый метод предполагает прикрепление ДНК к твердому носителю и гибридизацию меченой РНК или ДНК к прикрепленной ДНК. Метод, в котором тысячи различных ДНК прикреплены к твердой подложке известен как микрочип. В этой главе мы обсудим, как различные типы микрочипов сделаны и как они используются, и приведем примеры экспериментов с использованием микрочипов. Два других метода экспрессии генома используют секвенирование ДНК. Эти методы называются серийным анализом экспрессии генов (SAGE) и массивный параллельный сиквенс отпечатков (MPSS). Мы дадим краткий обзор того, как эти приемы выполняются. Наконец, мы обсудим ПЦР в реальном времени, которая все чаще используется как средство проверки уровня экспрессии РНК, первоначально обнаруженных с помощью анализа микрочипов.