1.3.6. Размораживание и удаление дмсо после оттаивания

При размораживании эмбрионов мыши, медленно охлаждавшихся (0,3-0,5°С/мин в1,5 ДМСО) перед быстрым охлаждением до -196°С, нужно выполнить следующие процедуры:

1. Если медленное охлаждение заканчивалось при -40°С, быстро нагревают образец со скоростью 50°С/мин, опустив его в воду при 40°С, помешивая воду ампулой.

2. Если медленное охлаждение продолжалось ниже -70°С, медленно нагревают образец со скоростью от 4 до 20°С/мин. Извлеките образец из ЖА и установите его на решетке, обеспечивающей скорость нагрева около 20°С/мин.

Поскольку охлаждение образца ведется в присутствии проникающего криопротектора, возникает необходимость удалить это соединение после размораживания клеток, чтобы избежать их повреждения в результате осмотического шока.

Вода обычно проникает легче, чем протектор, поэтому в результате разбавления суспензии транспорт воды в клетку будет превалировать над транспортом криопротектора из клетки и бластомеры разбухнут. Контроль степени разбухания принято осуществлять путем поэтапного удаления криопротектора из мышиных эмбрионов при 0°С или 20°С.

Ооциты после удаления ДМСО оплодотворяются in vitro, затем их переносят в псевдобеременную приемную мать. Оплодотворенные яйца и эмбрионы можно переносить мыши-реципиенту сразу же, но предварительный период культивирования повышает их выживаемость.

2. Метод витрификации

Цель исследований по витрификации состоит в упрощении процедур криозащиты эмбрионов. Известно, что высококонцентрированные растворы криопротекторов способны охлаждаться до низких температур без кристаллизации. В результате сверхохлаждения вязкость этих растворов настолько увеличивается, что они становятся стекловидно-твердыми; этот физический процесс называется витрификацией. При использовании витрификации эмбрионы уравновешиваются в смеси криопротекторов и после того как цитоплазма обезводиться, суспензию эмбрионов витрифицируют путем помещения в ЖА. Таким образом, витрификация обеспечивает простой и быстрый способ криозащиты эмбрионов.

Успех витрификации зависит от:

1. Состава витрификационного раствора.

2. Процедуры, применяемой для осмотического уравновешивания (эквилибрации) эмбрионов в растворе.

1. Эквилибрация.

Процедура эквилибрации разработана с целью получения концентрированной обезвоженной цитоплазмы, способной к витрификации при последующем охлаждении. Возможность получения эмбрионов зависит отчасти от степени проникновения криопротекторов, содержащихся в витрификационном растворе, в цитоплазму. Частичное проникновение, по-видимому, способствует успешной консервации, однако полное – повышает вероятность повреждения клетки вследствие химической токсичности и осмотического разбухания при разбавлении.

2. Охлаждение.

Проходит через 10 минут после переноса эмбрионов в 90% ВР витрифицируемой эмбриональной суспензии путем охлаждения в ЖА. Единственное требование касается скорости охлаждения: она должна быть достаточно высокой для предотвращения кристаллизации (> 20С/мин).

3. Хранение витрифицированных образцов.

Витрифицированные эмбриональные суспензии следует хранить при температуре -120 градусов Цельсия.

4. Нагрев.

Чтобы избежать повреждающее действие дефитрификации, длительно хранившиеся витрифицированные суспензии должны быть быстро нагреты (>200С/мин). Перенос образца в холодную воду (4С).

5. Разведение витрификационного раствора.

Его высокие концентрации токсичны.

1. Медленно. Крнцентрация раствора уменьшается в два приема при 4С, пока не достигнет 25 % концентрации исходного ВР. Затем оставшиеся внутри- и внеклеточные криопротекторы медленно разбавляются в несколько приемов при комнатной температуре.

2. Быстро. В раствор заменяется при 4С солевым раствором в состав которого входит сахароза.