1.3.1. Выбор среды для замораживания

Материал следует собирать и замораживать в средах со стабильной pH (от 7,2 до 7,4) в воздухе. Это необходимо для того, чтобы яйца и эмбрионы не повредились.

Перечень обычно используемых сред:

а) простой физиологический раствор (PBS);

б) забуференный фосфатом солевой раствор Дульбекко;

в) эмбриональная культуральная среда, забуференная HEPES

1.3.2. Криопротектор

Защитное действие на замораживаемые неоплодотворенные яйца и эмбрионы мыши оказывает целый ряд проникающих соединений, включая ДМСО, глицерол, метанол, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль. Для неоплодотворенных яиц эффективными криопротекторами служат ДМСО или глицерол.

На выживаемость эмбрионов влияют:

а) концентрации криопротектора;

б) скорость и температура, при которых криопротектор вносится в образец, а также время; экспозиции перед охлаждением до субнулевых температур;

в) скорость и температура, при которых протектор удаляется после оттаивания.

1.3.3. Индукция образования льда в суспензионной среде: «сидинг»

Для того чтобы не допустить переохлаждения, в образце индуцируют образование льда (сидинг) при температурах, следующих сразу ниже точки замерзания суспензионной среды.

1. После обработки образца ДМСО переносят в запаянную ампулу из ледяной бани при 0°С в баню с постоянной температурой -5-6°С (баня для сидинга)

2. Подождать 2 мин.

3. Индуцировать сидинг в образце, прикоснувшись к ампуле сразу над мениском концами тонкого пинцета, предварительно охлажденного в жидком азоте. Как только на стекле появится изморозь, убрать пинцет. Замечание: будьте осторожны, не переохладите образец.

4. Возвратите ампулу в баню для сидинга.

5. Через 5 мин, убедившись в том, что в образце сформировался лед, перенесите ампулу в охлаждающую баню при той же температуре, какая была в бане для сидинга.

1.3.4. Охлаждение

Если охлаждение идет слишком быстро, эмбрион не успевает адаптироваться до того момента, когда температура достигнет точки, при которой может произойти инициация кристаллизации, в результате содержимое клетки замерзает с образованием летальных количеств внутриклеточного льда. И напротив, если охлаждение идет слишком медленно, клетки подвергаются действию высоких концентраций внеклеточных растворов слишком долго, в результате изменяется pH и объем клеток уменьшается. В идеальном случае клетки должны охлаждаться со скоростью, достаточно медленной для того, чтобы они продолжали оставаться в осмотическом равновесии с внеклеточным раствором.

Для оптимальной выживаемости эмбрионов млекопитающих требуют относительно низких, по сравнению с другими клетками, скоростей охлаждения (0,2-2,0°С/мин). Скорость охлаждения измеряется в пределах от -10 до -60°С. Медленное охлаждение заканчивают при -40°С или при температурах -70°С погружением образца в ЖА.

1.3.5. Хранение в жидком азоте

После сидинга образец следует подвергнуть следующим процедурам:

1. Проконтролировать, чтобы температура охладителя отличалась от температуры бани для сидинга в пределах 0,5°С.

2. После уравновешивания температур ( ~ 5 мин, наблюдайте за температурой пустого образца) необходимо опустить ампулу в охлаждающую баню так, чтобы содержимое было ниже уровня охладителя.

3. Отрегулируйте наружный сосуд Дьюара, содержащий ЖА, чтобы он давал скорость охлаждения порядка 0,3-0,5°С/мин.

4. Прекратите медленное охлаждение, когда температура образца достигнет -40°С, или продолжайте охлаждать ниже -70°С. По достижении выбранной температуры извлеките ампулу из охлаждающей бани и погрузите ее в ЖА.

5. К следующему пункту приступайте через 15 мин.

6. Охладите алюминиевый контейнер для хранения ампул в ЖА.

7. Не извлекая ампул из ЖА, разрежьте резиновую полоску, прикрепляющую ампулу к держателю.

8. С помощью длинного пинцета, концы которого предварительно охлаждены в ЖА, загрузите ампулы в контейнер для хранения.

9. Перенесите контейнеры, погруженные в ЖА, в хранилище.