Лекция 8 Низкотемпературная консервация яиц и эмбрионов мыши Введение

Методы хранения ооцитов и эмбрионов в жидком азоте (ЖА) чрезвычайно важные для развития животноводства, биологии и медицины. Исследователь, работающий в области биологии развития млекопитающих, должен иметь в распоряжении обширный набор мутантных, инбредных и сингенных линий мышей. Наличие банка эмбрионов нужных генотипов позволяет не опасаться случайной утраты ценного генетического материала, ошибок скрещивания или болезней и дает возможность обойтись без дорогостоящего содержания животных, не требующихся в данное время. Упрощаются международные перевозки: транспорт эмбрионов дешевле и гуманней, чем транспорт животных.

Криоконсервация эмбрионов человека имеет особое значение в связи с проблемой бесплодия. Хранение неоплодотворенных яйцеклеток позволяет обойти правовые и этические ограничения, связанные с консервацией эмбрионов человека.

Метод консервации мышиных эмбрионов путем медленного охлаждения (0,2-2°С/мин) в присутствии диметилсульфоксида (ДМСО) и медленного оттаивания (4-25°С/мин) вскоре стал применяться для ооцитов мыши и эмбрионов других видов, включая человека.

2 Метода:

1) метод, используемый для замораживания ооцитов и эмбрионов.

2) метод витрификации, который позволяет получить живых эмбрионов.

1. Метод, используемый для замораживания ооцитов и эмбрионов

1.1. Источник ооцитов и эмбрионов

Неоплодотворенные или оплодотворенные яйца и эмбрионы на стадиях дробления получают в результате стимуляции овуляции у мышей инъекциями ГСЖК и чХГ (человеческий хориогонический гонадотропин).

1.2. Сбор ооцитов и эмбрионов

Для освобождения недавно овулировавших ооцитов из яйцевода между 13 и 14,5 ч после инъекции чХГ стенки ампулы разрывают глазным пинцетом.

Оплодотворенные яйца и эмбрионы на стадиях дробления вымывают из репродуктивного тракта через определенные интервалы времени после овуляции или инъекции чХГ.

1.3. Замораживание

Причиной летального исхода может быть как механическое повреждение клетки кристаллами льда, так и осмотический шок в результате образования или таяния льда.

Поэтому успех замораживания яиц и эмбрионов зависит от степени обезвоживания клеток, препятствующей формированию внутриклеточного льда.

Удаление воды из клеток производится одним из двух способов.

1. При субнулевых температурах: во время образования льда в суспензионной среде концентрация внеклеточных растворов возрастает, давление паров воды внутри клетки становится выше, чем снаружи, и вода устремляется из клетки через мембрану для установления равновесия.

2. Перед охлаждением до субнулевых температур: прибавление раствора сахарозы к суспензионной среде приводит к частичному обезвоживанию бластомеров.

Описанные здесь методы основаны на процедурах охлаждения, разработанных для консервации эмбрионов. Важнейшие характеристики данных методов:

1. выбор суспензионной среды;

2. присутствие криопротекторов в процессе охлаждения;

3. индукция образования льда (сидинг) при температуре ниже точки замерзания среды;

4. медленное охлаждение (-0,5°С/мин), заканчивающееся при -40°С или при температурах ниже -70°С в результате погружения в жидкий азот (ЖА);

5. хранение при -196°С в ЖА;

6. осторожное удаление криопротектора после оттаивания для предотвращения осмотического шока.