3.2. Другие варианты переноса ядер

Гетерозиготные диплоидные гиногенетические яйца могут быть получены способом, описанным выше, или путем использования гаплоидных партеногенетических яиц. Развитие гетерозиготных яиц с материнским геномом не отличается от развития от развития партеногенетических яиц, которые были диплоидизированы путем подавления формирования второго полярного тельца. Подобным образом можно получить разнообразные анеуплоидные яйца. Перенос в перивителлиновое пространство в течение короткого времени одного за другим нескольких кариопластов, может привести к их слиянию с плазматической мембраной яйца и к созданию триплоидных или тетраплоидных яиц с разным числом материнских и отцовских геномов.

Техника манипуляций с ядрами от эмбрионов более поздних стадий развития в основном та же, что и описанная выше. Размер пипетки для переноса должен быть немного изменен в соответствии с размером трансплантируемого ядра. Ядра эмбрионов на 8-клеточной и более поздних стадиях эмбрионального развития часто бывают плохо видны, особенно трудно проследить за слиянием нуклеопласта с яйцом. Существует возможность переноса ядер в 2-клеточные бластомеры. В этом случае, как бы тщательно ни была проделана операция, кариопласт имеет тенденцию проскользнуть в щель между бластомерами, поэтому имеет смысл оставлять оперированные эмбрионы в манипуляционной камере и наблюдать за ними, пока не произойдет слияние. Таким образом, можно получить 2-клеточные химеры.

3.3. Кариопласты с минимальным количеством цитоплазмы

Если требуются ядра или пронуклеусы, практически лишенные цитоплазмы, в частности, для биохимического анализа, они могут быть приготовлены в виде кариопластов с минимальным объемом цитоплазмы. Существуют 2 способа уменьшения объема цитоплазмы, следующей за ядром в энуклеационной пипетке.

1. Сделать так, чтобы ядро выступило из кончика пипетки, а затем провести ее через границу разделения среда/масло, пока кариопласт не оторвется от цитоплазмы, оставшейся в пипетке.

2. Ввести часть кончика энуклеационной пипетки в конец удерживающей пипетки, немного выпустить ядро из энуклеационной пипетки, а затем к обеим пипеткам приложить небольшое отрицательное давление; кариопласт разорвется сразу позади ядра.

Описанные операции позволяют получить кариопласты, в которых цитоплазма составляет 10% общего объема, но чем мельче ядра, тем труднее получить это соотношение.

3.4. Разделение яиц

В тех случаях, когда обработка яиц цитохалазином или другими ядами нежелательна и требуются крупные кариопласты, их можно получить оперируя освобожденные от блестящей оболочки яйца. Яйцо осторожно втягивают в удерживающую пипетку и снова выпускают, вследствие чего оно принимает удлиненную форму; сплошную иглу помещают поперек яйца в месте предполагаемого разделения и опускают через границу среда/масло. Тем же способом можно удалить одно полярное тельце или оба.

4. Оценка результатов

Частота слияния во многом зависит от качества препарата вируса Сендай. При хорошем качестве препарата и соблюдении всех условий частота слияния превышает 90%. Если реконструкция яйца осуществилась, с ним можно обращаться как с любым другим яйцом. Такие яйца можно культивировать in vitro для изучения предимплантационного развития или перенести псевдобеременным реципиентам для наблюдения для развития in vivo. Эмбрионы 1-, 2- или даже 4-клеточной стадии могут быть перенесены в яйцеводы реципиента 1-го дня, а на стадии поздней морулы/ранней бластоцисты – в матку реципиента 3-го дня. (При этом рекомендуется в другой яйцевод или рог матки перенести нормальный эмбрион для контроля эффективности псевдобеременности и оценки индивидуальных различий.) Реконструированные яйца можно использовать при получении агрегационных химер или при конструировании бластоцист, а также для анализа белков и ферментов или хромосом.

Развитие диплоидных партеногенетических, гиногенетических или андрогенетических эмбрионов после их переноса псевдобеременным реципиентам редко продолжается дольше 10 или 11 дня. На этой стадии их морфологическая организация в большей или меньшей степени аномальна, но ткани живы и достаточно здоровы, чтобы быть объектом биохимического анализа. Химеры, полученные комбинацией аномальных эмбрионов с нормальными, предоставляют возможность анализа на поздних стадиях беременности или после рождения.