2.2. Оплодотворенные яйца

Чтобы получить максимальное число яиц, у самок F1 (в возрасте примерно 28 дней) индуцируют суперовуляцию, сразу после чего подсаживают к самцам, одну самку к одному самцу. На следующее утро самок проверяют на наличие копулятивной пробки.

Яйца с пронуклеусами получают от самок утром первого дня беременности и освобождают их от клеток кумулюса гиалуронидазой.

2.3. Активирование яиц

Активацию неоплодотворенных яиц можно стимулировать разнообразными воздействиями. Например, метод Катбертсона подразумевает использование этанола в качестве активирующего агента.

1. Яйца от суперовулировавших, но не спарившихся самок, собирают через 17-18 часов после инъекции ХГЧ.

2. Удаляют клетки кумулюса обработкой гиалуронидазой.

3. Подвергают действию 7%-ного этанола на 4,5 минуты.

4. Если требуются гаплоидные партеногеноны, яйца культивируют. В течение 4 ч формируется гаплоидный пронуклеус и полностью выделяется второе полярное тельце.

5. Для получения диплоидных партеногенон подавляют формирование второго полярного тельца, при этом оба продукта второго мейотического деления остаются в развивающемся яйце. Сразу после активации и отмывки яйца подвергают действию цитохалазина B и инкубируют в течение 3-4 ч. К этому времени в цитоплазме становятся четко видны 2 пронуклеуса. Яйца осторожно отмывают, возвращают в культуру и спустя 2 ч, когда они оправятся от обработки, тщательно просматривают и все аномальные отбрасывают.

2.4. Предимплантационные эмбрионы

Эмбрионы на стадиях дробления, используемые в экспериментах по трансплантации ядер, могут быть получены либо вымыванием их из яйцевода или матки, либо путем культивирования начиная с 1- или 2-клеточной стадии in vitro.

3. Перенос ядер

3.1. Извлечение и перенос ядер

В качестве примера – получение гетерозиготных диплоидных андрогенетических яиц.

1. Яйца собирают примерно через 18 ч после инъекции, удаляют клетки кумулюса и культивируют в течение 1 ч.

2. Отбирают ранние пронуклеарные яйца и сортируют их в зависимости от положения пронуклеуса. Те из них, у которых пронуклеусы занимают четко периферическое положение, используют в качестве реципиентов, а яйца более поздних стадий со сближенными и более крупными пронуклеусами – в качестве доноров.

3. Готовят яйца-реципиенты, удаляя женский пронуклеус. Ориентируют яйца в капле среды таким образом, чтобы при удерживании его за область полярного тельца оба пронуклеуса были в фокусе и чтобы у прижатой к яйцу скошенной пипетки мужской пронуклеус остался позади, а женский лежал впереди. Это помогает более четко различать пронуклеусы после вхождения пипетки, когда морфология яйца изменяется. Чтобы сделать правильный выбор между пронуклеусами, следует учитывать, что женский пронуклеус обычно имеет заметно меньшие размеры и на ранних стадиях располагается вблизи от второго полярного тельца. Поскольку спермий может войти в яйцо в любой точке поверхности, мужской пронуклеус иногда может занять аналогичное положение по отношению к полярному тельцу. Абсолютные размеры пронуклеусов на любой стадии могут варьировать у разных яиц, но женский пронуклеус всегда меньше. С другой стороны, у яиц более поздних стадий, где пронуклеусы мигрировали к центру и увеличились, различия в размерах иногда перестают быть очевидными. Яйца, у которых идентификация пронуклеусов вызывает сомнения, следует отбросить.

4. Яйцом осторожно, но прочно захватывают удерживающей пипеткой, при этом часть блестящей оболочки и района полярного тельца засасывается в удерживающую пипетку.

5. Энуклеационную пипетку вдавливают в блестящую оболочку, не прорывая мембрану.

6. Кончик пипетки придвигают к женскому пронуклеусу и осторожно сообщают пипетке небольшое отрицательное давление. Мембрана яйца, деформируясь, втягивается в пипетку, за ней следует пронуклеус.

7. Как только пронуклеус оказывается внутри кончика пипетки, ее осторожно выдвигают из блестящей оболочки. При этом мембрана яйца остается в узкой трубке конца пипетки. Это выпячивание мембраны отщипывают, скользнув кончиком пипетки по краю отверстия в блестящей оболочке. Разорванные края мембраны яйца обычно сливаются по обе стороны разрыва.

8. Операции повторяют со всеми яйцами-реципиентами и переносят женские пронуклеусы в новую каплю.

9. Переходят к донорским яйцам. Прочно захватывают яйцо удерживающей пипеткой.

10. Проходят пипеткой через блестящую оболочку и захватывают небольшой фрагмент цитоплазмы; отщипывают от яйца этот цитопласт. Он будет выступать в роли буфера.

11. Извлекают мужской пронуклеус.

12. Энуклеационную пипетку вводят в каплю суспензии вируса Сендай.

13. Сообщают пипетке положительное давление, достаточное для того, чтобы нуклеопласт частично вышел из кончика пипетки и омывался вирусной суспензией, затем втягивают его обратно так, чтобы небольшой объем вирусного препарата занял кончик пипетки.

14. Пипетку извлекают из этой капли. В поле зрения ставят каплю с яйцами-реципиентами и захватывают яйцо так же, как при энуклеации.

15. Вводят пипетку для переноса в первоначальное отверстие в блестящей оболочке и осторожно выпускают вирусный препарат и нуклеопласт в перивителлиновое пространство. Как только пронуклеус оказывается в блестящей оболочке , выводят пипетку, отщипнув излишки цитоплазмы. Слияние может произойти в любой момент примерно в течение следующего часа, а иногда и через несколько минут после переноса.

16. Повторяют процедуру со всеми реципиентными яйцами.

17. Яйца промывают и культивируют в стандартной среде.