Лекция 7. Трансплантация ядер в оплодотворённые и партеногенетически активированные яйца Введение

Современные методы трансплантации ядер позволяют вмешиваться в генетическую организацию яиц и эмбрионов мыши. Благодаря этим методам удалось достигнуть больших успехов в ряде областей биологии развития, в частности в изучении:

• вклада материнского и отцовского геномов в развитие;

• ядерно-цитоплазматических отношений;

• морфогенетических потенций ядер, трансплантированных в яйца из эмбриональных клеток и возможностей их «клонирования»;

• репродукции млекопитающих путем партеногенеза.

Эти исследования позволили по-новому осмыслить функциональные различия между геномами родителей, однако, точные механизмы ограничения роста у яиц, получивших донорские ядра с более поздних стадий развития, или у партеногенетических яиц пока не известны.

Поскольку пронуклеусы и ядра яиц и ранних эмбрионов имеют относительно крупные размеры, введение в яйцо пипетки с диаметром отверстия, достаточным для захвата такого ядра, обычно необратимо повреждает мембрану яйца и приводит к лизису. В связи с этим используют метод извлечения ядра в небольшом объеме цитоплазмы. Такие нуклеопласты могут быть слиты с другими яйцами или клетками с помощью вируса Сендай. Этот метод позволяет получить в ходе одного четырехчасового эксперимента до 100 энуклеированных яиц или 40-50 реконструированных яиц.

1. Вирус Сендай

Вирус Сендай, или гемагглютинирующий вирус (японский штамм), используется в качестве фузогена (фактора, вызывающего слияние клеток).

Для получения препарата вируса, им заражают 11-дневные куриные эмбрионы. Затем их культивируют еще 3 дня, убивают низкотемпературной инкубацией в течение ночи и извлекают содержащую вирус аллантоисную жидкость.

Перед использованием вируса в экспериментах, его инактивируют ультрафиолетом или бета-проприолактоном (гораздо более эффективный метод).

Так как БПЛ является потенциальным канцерогеном и крайне лабилен при температурах выше 4 градусов по Цельсию, работают с ним крайне осторожно.

2. Яйца и эмбрионы

2.1. Линии мышей

При выборе линии мышей для получения яиц следует учесть два момента:

1. Часто возникает необходимость культивировать оперированные яйца одноклеточной стадии в течение нескольких дней, прежде чем приступить к следующему этапу эксперимента. Однако известно, что у мышей большинства линий развитие яиц in vitro блокируется на 2-клеточной стадии. Исключение составляют гибридные эмбрионы, полученные на основе C57BL. Кроме того, для гибридов комбинации C57BL/CBA отработаны надежные условия активации яиц.

2. При анализе результатов эксперимента удобно для доказательства функциональности трансплантированного ядра использовать такие маркеры, как окраска шерсти или ферментативная активность. Например, животные F1 от скрещивания самок C57BL и самцов CBA имеют окраску черную агути и являются гомозиготами по B-форме глюкозофосфатизомеразы (ГФИ-1В). Для обеспечения надлежащего контраста с ними скрещивают мышей аутбредной альбиносной линии (CFLP), которые в результате тщательного скрининга и скрещиваний стали гомозиготными по изозиму А ГФИ. Яйца от самок F1, спаренных с самцами CFLP используются для получения андрогенетических или гиногенетических яиц.